外泌体在不同肝炎及其相关疾病中的研究进展①

肖佳妹 杨岩 赵佳柱 杨岩涛（湖南中医药大学药学院，长沙 410208）

肝脏是人体新陈代谢的重要器官，参与机体的再生、凝血、免疫、解毒、三大物质代谢、生物转化和内分泌调节等。肝炎是由微生物感染、免疫反应、药物作用等多种因素引起的肝脏炎症性疾病，严重危害人类健康。肝炎主要分为病毒性肝炎和非病毒性肝炎两大类，肝损伤以及炎症介质释放增加容易导致肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）、肝硬化乃至肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生。肝活检是获取肝脏组织病理学检查和诊断的金标准，它是对整个肝组织的一小部分进行取样，对肝病的诊断仍有一些局限性，很难准确诊断出肝病的各个阶段。最常用的检测指标是血液中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartic transaminase，AST）的酶促活性，但需要新鲜血液样本，且血清ALT和AST的升高并非肝损伤的特异性指标［1］，因此亟需一种新型非侵入性分子生物标志物作为肝病诊断和预后判断的工具。

近年来，细胞来源的微小膜泡，特别是外泌体（exosomes，EXOs）引起了广泛关注，EXOs是由天然脂质双层构成，直径为40~100 nm的盘状囊泡，系由各种类型的细胞释放分布到血液、唾液、汗液和尿液等生物流体中，主要由细胞特异性蛋白、糖蛋白、脂质、核酸等分子组成，可介导特定的细胞间通信，在细胞间通信和触发生理反应过程中发挥重要作用，影响信号通路、细胞间通信、肿瘤进展和分子转移［2］。EXOs无独特的标志蛋白，其蛋白质含量差异主要取决于细胞的来源，其富含多种脂质，可作为脂质载体，携带多种生物活性脂质转运至受体细胞，其核酸成分是功能性RNA分子，mRNA和其他非编码RNA。EXOs中RNA与亲代细胞中的RNA明显不同［3］。EXOs主要通过细胞内吞作用或者直接与靶细胞融合、表面配体与细胞膜表面的受体特异性结合、表面蛋白经水解后与靶细胞表面受体结合等3种方式，将内含物转移到靶细胞内进行调控进入靶细胞［4］。EXOs参与人体许多重要的生理病理过程，影响疾病的发生、发展［5］。在肝脏中，EXOs由肝细胞、非实质肝细胞和免疫细胞分泌，表现出亲代细胞的生物学“快照”，其释放内容根据亲代细胞的刺激状态和分化阶段而动态变化，参与代谢性障碍引起的肝脏疾病、酒精性肝病、病毒性肝炎及肝细胞癌等疾病的发病，是肝病新的潜在诊断和治疗手段［6-8］。因此，尝试对EXOs在不同类型肝炎及相关疾病中的作用与价值进行综述，探索EXOs对肝脏疾病的潜在诊断和治疗作用，为肝脏疾病的临床治疗提供新的思路。

1 EXOs在肝炎中的作用

1.1 EXOs在病毒性肝炎中的作用病毒性肝炎是由肝炎病毒引发的传染病，EXOs作为细胞间重要的通信工具，在病毒性肝炎发病机制中扮演重要的角色，参与病毒感染期间的病毒传播、免疫调节和抗病毒反应。感染了肝炎病毒的肝细胞产生的EXOs携带着病毒RNA、细胞miRNA、蛋白质及其他宿主功能性遗传元件并转染给正常肝细胞，使感染扩散并破坏慢性病毒性肝炎的先天免疫反应［9］。但与此同时，EXOs也会激活人体的免疫功能来应对感染，表现出了传播病毒和抗病毒反应的双向作用，因此，EXOs作为抗病毒或疫苗的候选物治疗病毒性肝炎具有巨大的潜在价值［10］。

1.1.1 甲型病毒性肝炎（hepatitis A virus，HAV）

HAV主要通过粪便经口传播，以包膜形式存在，在遗传和物理上都异常稳定的小核糖核酸病毒，不会引起慢性肝病且很少致命，但会引起衰弱的症状和急性肝衰竭［11］。HAV无法自行繁殖，需要进入其宿主细胞并劫持其以产生新的病毒颗粒。被感染的人类细胞能够产生两种不同类型的甲型肝炎颗粒，一种是“裸露”病毒颗粒，稳定的存在于受感染者的粪便中；另一种称为“准包膜”病毒的颗粒，存在于受感染个体的血液中，该膜可保护蛋白质外壳免受人类免疫反应，从而使准包裹的病毒颗粒以隐身方式在肝脏内传播，溶酶体能够降解病毒膜，从而导致准包裹的病毒解体，目前尚不清楚这两种不同类型的病毒颗粒是以何种方式进入细胞［12］。研究发现，肝细胞释放的HAV粒子被宿主膜吞噬，在感染细胞的EXOs中，保护病毒体免受抗体介导的中和作用［13］。这些EXOs具有充分的传染性，通过膜掩盖使它们与宿主免疫系统隔离，在受感染人类的血液中循环，HAV对膜的劫持有助于中和抗体的逃逸以及促进病毒在肝脏中的传播，但被EXOs或者包膜包裹的HAV粒子会限制eHAV感染后的复制，比裸露的粒子更慢地将其RNA释放到细胞中［13］。磷脂酰丝氨酸受体HAVCR1被广泛接受为HAV的受体，被命名为“甲型肝炎病毒细胞受体

1”（hepatitis A virus cell receptor 1，HAVCR1），HAVCR1和胆固醇转运NPC1通过网格蛋白介导的内吞作用参与HAV感染细胞EXOs（exo-HAV）的货物运输，通过exo-HAV介导HAV促进感染，说明EXOs和病毒共有不依赖包膜糖蛋白的融合机制，纠正了HAVCR1是允许HAV进入细胞的必需细胞受体的结论，这为确定特定肝病毒进入因素奠定了基础［14-16］。因此，值得深入研究EXOs在HAV传播以及避免免疫反应过程中的作用及exo-HAV在先天免疫和免疫逃避中的方式，将有望推动未来的疫苗开发。

1.1.2 乙型病毒性肝炎乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是导致肝硬化、HF和HCC的主要因素。HBV持续复制和机体免疫功能低下诱发的肝脏组织免疫损伤可导致乙型肝炎慢性化。研究表明，与免疫相关的miRNA中miR-122、miR-146a可参与炎症反应和免疫应答，在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患 者 血 清EXOs中miR-122与HBV-DNA的载量成正比，而miR-146a的水平呈现相反趋势［17-19］。miR-199a-3p和miR-210可有效降低乙肝表面抗原（HBsAg）的表达，抑制HBV复制，该发现揭示了EXOs可能是HBV传播的重要调节剂，介导了HBV的细胞间传播，并可能具有调节先天免疫应答的作用，充当潜在的免疫逃逸机制［20］。IFN-α具有抑制HBsAg和HBV共价闭合环状DNA的能力，可有效抑制HBV复制并表达抗病毒活性［21］。巨噬细胞来源的EXOs利用病毒进入机制和途径（内吞作用和巨胞饮作用）将巨噬细胞中与IFN-α相关的miRNA转移到感染HBV的肝细胞中，有效转移IFN-α诱导的抗HBV活性［22］。这为有效控制肝细胞中HBV复制提供了理想的策略，同时也暗示EXOs的细胞进入机制和途径将有助于EXOs作为抗病毒治疗的有效载体。

1.1.3 丙型病毒性肝炎丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一个正链RNA病毒，全世界有超过7 100万人受到感染［23］。目前尚无有效的HCV疫苗，如果不及时治疗，将有可能进一步发展为HF、肝硬化和HCC。研究表明，HCV可以劫持细胞释放EXOs，从而逃避宿主免疫，并随着EXOs将感染转移到非感染肝细胞、瘤细胞或原代人肝细胞中，并在这些新感染的细胞中触发病毒复制，构成HCV感染和传播的一种新形式，且部分抵抗抗体中和，揭示了其潜在免疫逃避机制［24］。同时研究证明，HCV相关EXOs通 过STAT3-miR124轴 诱 导RUNXOR和RUNX1表达，RUNXOR和RUNX1的上调增强髓样来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的分化及其抑制宿主的免疫反应，形成了慢性病毒感染过程中HCV逃避宿主免疫一策略［25］。如何抑制EXOs介导的细胞间通信将是控制HCV传播的有效方法，研究发现，载有miR-122抑制剂的HCVEXOs可导致Huh7.5细胞内miR-122水平显著降低，表明EXOs中的HCV传播可被EXOs内的miR-122或HSP90抑制所阻断。此外使用特定的液泡H+-ATPase质子泵抑制剂bafilomycin A1和质子泵抑制剂Lansoprazole也可防止EXOs和无细胞病毒传播感染的能力，从而防止EXOs介导的病毒传播［26］。因此，有效地阻断宿主EXOs介导的HCV传播将为抑制HCV的发展和治疗提供可行的方法和思路。

1.1.4 戊型病毒性肝炎戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染可导致急性或暴发性肝炎，并在免疫功能低下宿主中变为慢性。研究发现，粪便和胆汁中存在的HEV颗粒没有被包裹，而循环血液和培养上清液中的HEV颗粒则被类似于EXOs膜的细胞膜覆盖，HEV颗粒通过EXOs途径从感染细胞中释放［27］。来自粪便的HEV被抗HEV抗体以剂量依赖性方式中和，而来自培养上清液的与EXOs相关的HEV受到免疫反应的保护，仍然具有传染性，可能导致其宿主中HEV的广泛传播，对EXOs途径进行阻断可以帮助HEV以可控的方式繁殖［28］。研究表明，非包膜的HEV和准包膜的HEV（quasi-envel⁃oped HEV，eHEV）是利用不同的机制进入细胞，eHEV进入细胞的主要途径通过网格蛋白介导的内吞作用，与非包膜HEV病毒体相比，eHEV与细胞的结合效率要低得多，需要更长的接种时间才能达到其最大感染力［29］。将eHEV膜在溶酶体中降解，实现脱膜，则会大大增加其感染性，这将是一种潜在的新型病毒进入机制，因此，阐明eHEV对细胞的感染机制对于了解其发病机理以及治疗具有重要的作用。

1.2 EXOs与酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）酒精及其代谢产物过多可引起肝脏损伤和炎症。AH可从脂肪变性逐渐转化为肝硬化、肝炎及HCC，目前尚无潜在生物标志物监测AH患者的肝损伤程度。AH的特征是miRNA的表达失控，在AH患者的肝脏和血清中评估miRNA的表达发现miR-182是AH中表达最高的miRNA，与导管反应程度、疾病严重程度和短期死亡率相关，显示miRNA在AH中具有作为治疗靶标和生物标志物的潜力［30］。与健康对照组相比，AH患者血浆中的EXOs数量显著增加，其中miR-309、miR-30a和miR-192大幅度增加，对鉴定酒精引起的肝损伤具很高的诊断价值，且miR-192对AH具有明显的区分能力，可作为针对AH诊断和监测的新潜在生物标志物［31］。通常自噬可以维持细胞的稳态，但因酒精会增加肝细胞和巨噬细胞中EXOs的释放，miR-155过度表达会破坏溶酶体相关膜蛋白的自噬功能，在AH小鼠模型及患有酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）小鼠均具有自噬功能受损的现象，而miR-155缺陷小鼠不仅免受酒精诱导的自噬破坏，而且EXOs的释放减少。以上结果表明，酒精诱导的EXOs释放增加与自噬的破坏以及自噬和溶酶体功能受损有关，miR-155可作为酒精相关调节自噬和EXOs在肝细胞和巨噬细胞中产生的重要调节剂［32］。综上，EXOs水平升高及与EXOs相关miRNA的表达可转运酒精诱导的肝损伤特异性分子信息，是AH诊断、监测和治疗新的潜在生物标志物。

1.3 EXOs与自身免疫性肝炎（autoimmune hepati⁃tis，AIH）AIH是肝脏的炎症性疾病，以急性或慢性形式存在，被机体免疫细胞攻击的肝细胞遭受破坏会导致肝脏炎症坏死，并进一步发展成为肝纤维化及肝硬化［33］。在所有年龄和性别的人群中都可能会发生，并且最近被公认为是一种全球性疾病［34］。其特征是转氨酶水平升高，自身抗体升高［35］。皮质类固醇或与硫唑嘌呤相关的皮质类固醇的给药是AIH的常规治疗策略，并无其他有效的治疗方法。但也有患者在类固醇戒断后可能会出现强烈的副作用或复发［36］。因此，亟需新的免疫抑制剂或新的替代疗法用于AIH的治疗。已有实验证明EXOs是炎症和免疫调节剂［37］。携带miR-223-3p的骨间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）EXOs可 以 减 弱 小 鼠 肝S100/CFA诱 导 的AIH发育，机制与miRNA-223-3p介导的STAT3基因和炎症细胞因子（IL-1β和IL-6）表达调节以及Treg/Th17升高有关，表明BMSC EXOs可用于递送miR-223-3p，以减轻AIH引起的肝损伤，为开发AIH患者的治疗方法提供了一种新的策略［38］。有必要进一步对EXOs在AIH发病机制及治疗展开研究，阐明EXOs如何特异性靶向肝脏或其他器官，为AIH的治疗提供新的研究方案。

1.4 EXOs与非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）NASH是排除饮酒和其他明确致病因素造成的肝损伤后，因其他原因引起的肝脏内出现脂肪过度沉积和炎症反应的临床病理综合征［39］。目前还未有疗效确切的药物治疗NASH，临床上多是通过降脂调脂、调节肠道菌群保护肝脏来治疗NASH［40］。肝活检仍是确认NASH的唯一可靠方法，但该诊断方法在准确性和效率上仍受到限制，细胞EXOs生物学的研究为开发一种非侵入性的生物标志物来对NASH进行诊断和分期并为阐明其发病机理提供机会［41-42］。研究发现，肝细胞来源的微粒联系着肝细胞脂毒性和血管生成，在饮食引起的脂肪性肝炎的小鼠血液中检测到大量肝细胞来源的微粒，表明饮食引起的脂肪性肝炎可促进EXOs水平的变化，而EXOs的水平是疾病严重程度的早期标志，可反映肝脏的病理学变化［43］。胞外酶Vanin-1（VNN1）的RNA干扰可保护小鼠免受脂肪性肝炎诱导的肝脏病理性血管生成，并导致微粒丧失促血管生成作用，可作为治疗NASH以及肝损伤的生物标志物［44］。在NASH患者的血清中miR-192-5p水平与肝炎性活动评分和疾病进展呈正相关，肝细胞源性的EXO miR-192-5p通过调节Rictor/Akt/FoxO1信号传导在促炎症巨噬细胞活化和NASH疾病进展中起关键作用，可作为NASH的潜在非侵入性生物标志物和治疗靶标［45］。在脂肪性肝炎中肝细胞miR-122的表达明显降低，尤其是在纤维化阶段。肝和肝细胞中miR-122的降低有助于上调组织重塑调节剂（HIF-1α、波形蛋白、MAP3K3），在NASH诱导的肝纤维化中发挥作用［46］。表明在临床应用上，EXO miRNA有潜力作为监测NASH的新型生物标志物，能阐明它们作为液体肝活检的潜在作用将会准确地为非侵入性诊断NASH和监测疾病进展提供支撑。

1.5 EXOs与药物性肝炎药物性肝炎是指在治疗的过程中，由于药物或其代谢产物所引起的肝脏毒性损害或过敏反应，也是常见的肝脏疾病之一。临床上，根据发病进展可分为慢性药物性肝炎和急性药物性肝炎。一旦确诊为药物性肝炎，其治疗原则应是立即停止或阻断引起肝炎的药物，再进行相应的针对性治疗。与病毒性肝炎、自身免疫性肝病不同的是药物性肝炎无特异性的病毒学或免疫学标志，诊断困难，临床上多通过测定患者肝功能指标以及常规检查进行确诊，尚无明确的诊断标准［47-48］。乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）引起的急性肝衰竭是药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）和死亡率的主要原因，对暴露于APAP的小鼠EXOs进行蛋白质组学分析表明，富含蛋白质的血清组分中miR-122水平升高，与对照组相比，肝特异性蛋白和肝毒性蛋白的含量以剂量和时间依赖性方式显著增加。在药物介导的肝损伤中循环的EXOs含有肝特异性蛋白，可作为肝毒性的特异性生物标志物［49-50］。基于EXOs细胞间通信的生物学功能，来自APAP引起的肝损伤小鼠的外源性EXOs促进了活体小鼠肝细胞或肝癌细胞的死亡以及肝损伤，其潜在机制可能是由于EXOs参与了细胞之间的交流，提高了原代肝细胞中与细胞死亡信号通路相关的mRNA转录和蛋白，增强细胞毒性，进而影响相邻肝细胞或肝脏中的其他细胞的生理状态，因此降低EXOs的扩散与传播将有利于疾病的控制［51］。但研究证明，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源的EXOs可以通过上调Bcl-xL抑制APAP和H2O2诱导的肝细胞凋亡蛋白表达，但不能通过调节氧化应激减轻肝细胞损伤，体现了其通过激活增殖和再生反应来引发针对毒物诱导损伤的肝保护作用［52］。因此，EXOs在DILI模型中既有促进细胞毒性作用，又可对损伤后肝脏表现出其恢复与再生的作用，在未来有望为药物诱导的肝毒性提供新型辅助治疗。

2 EXOs与肝炎相关疾病的关系

EXOs在不同类型肝炎中可通过与其他细胞的相互作用以及影响多种肝细胞之间的信号传导来诊断和检测肝炎的发病历程。若对肝炎症疾病不及时进行控制和治疗则可逐渐转化为HF和HCC。实际上，EXOs还参与肝炎相关疾病的迁移与治疗，因此，了解肝细胞如何通过EXOs进行交流以及每种细胞类型特异性外泌体的功能将有助于肝病的研究。

2.1 EXOs与HF HF由肝脏长期慢性损伤后不溶性胶原蛋白和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的过量生产和积累引起的，产生了大量的炎症介质和细胞外因子，是一种病理性疾病。解决HF就需要抑制巨噬细胞的活化和降低细胞因子分泌的能力，重塑ECM的产生并减少纤维疤痕的能力，从而减少促炎介质、纤维化细胞因子和ECM的产生，再通过灭活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）抑制纤维细胞活化，才能控制纤维化的发生和发展［53］。HF的形成与HSC的活化关系密切，研究发现，EXOs含有逆转纤维化的能力，人类BMSC衍生 的EXOs（hBM-MSCs-Ex）可 通 过 抑 制Wnt/βcatenin信号传导来防止HSC活化，从而降低肝纤维化［54］。正常健康个体中的血清EXOs具有抗纤维化作用，miR-34c，-151-3p，-483-5p，-532-5p和-687在正常小鼠中的表达要比纤维化小鼠高，这些micro-RNA可以抑制活化HSC中的纤维生成基因表达［55］。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iP⁃SC）在生理上产生和释放被HSC内在化的细胞EXOs也可以调节HSC活化并具有抗纤维化的作用［56］。表明EXOs作为潜在的新型抗纤维化生物制剂，对抗纤维化具有积极的治疗作用，并对治疗与纤维化相关的各种肝脏疾病具有重要的转化意义。另一方面，源自HSC的EXOs具有促进HF的作用，激活HSCs会释放富含纤维蛋白的EXOs，研究发现HSC中的自噬可以通过抑制纤维化EXOs的释放而减弱了肝纤维化［57］。表明EXOs代表了一种新的潜在病理状况的生物标志物在鉴定和治疗与肝纤维化相关疾病中具有巨大的潜力。

2.2 EXOs与HCC HCC也称为原发性肝癌，是一种高度致死性的癌症，也是肝硬化患者的主要死亡原因。中国占全球病例和死亡总数的50%［58］。因此，对肝癌进行早期诊断和治疗显得尤为重要，典型的HCC诊断方法包括影像学方法［（如超声检查、血清甲胎蛋白、CT、MRI）和组织学分析（肝活检）］，但影像学方法难以检测和区分小结节，而组织学分析则具有侵袭性并具有高风险。血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的水平已被用作HCC诊断的标志物，是检测HCC常见且重要的早期诊断方法，但该生物标志物的特异性较低［59］。由于在大多数情况下，肝硬化先于HCC，因此建议对此类高危患者进行早期检查，这将是改善这些人长期预后的迫切需要，以便更好地控制疾病的发生发展。研究表明，与正常肝组织相比，miR-21、miR-221和miR-222在HCC组织中的表达量增加［60-62］。而miR-122-A、miR-145、miR-199-A和miR-223表 达 量 减少［63-65］。此外，miR-338与HCC的特征密切相关，包括肿瘤大小、分化、血管浸润和肝内转移［66］。拮抗非蛋白编码RNA的循环EXOs分化与HCV相关的HCC的疾病进展高度相关，可能是HCV相关HCC的非侵入性预后生物标志物［67］。miR-125b-5p和miR223-3p可以在很早甚至在肝病的CHB阶段就用作HBV阳性HCC的新型非侵入性生物标志物［68］。表明对EXOs进行诊断和追踪有利于筛查高危人群，并及时反映疾病的病理过程，有利于控制疾病的发展。EXOs不仅在HCC发生发展过程中作为诊断的潜在生物标志物，还可以为HCC的生物免疫治疗提供新思路。在正常组织或细胞中，免疫系统可以识别差异并激活免疫反答以清除癌细胞，然而，在肿瘤细胞中，肿瘤细胞可以欺骗免疫细胞和逃避免疫监视［69］。研究发现肿瘤来源的EXOs通过刺激巨噬细胞增加IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的分泌，激活STAT3途径并增加其分泌来抑制免疫细胞的活化，从而导致免疫逃逸，恢复肝癌细胞的免疫原性并重新建立体内免疫清除机制成为了HCC治疗的主要研究方向［70］。但有研究发现抗HCC的药物诱导EXOs具有良好的抗原性并可以激活免疫反应，作为HCC治疗的一种免疫诱导剂具有很强的优势，其可绕过肝的免疫抑制环境，可用作潜在的HCC治疗疫苗。以上分析可知通过阐明HCC相关EXOs的调节机制及其信号传导途径，并分析其在HCC的诊断和治疗中的临床应用，EXOs不仅可以作为HCC的新型诊断和预后分子生物标志物，还可以弥补常规检测中无法实现对晚期HCC治疗的准确疗效评估的不足，为今后的HCC治疗疫苗开发提供有用的线索。

3 讨论

目前，对于肝脏性疾病的黄金检测标准仍然是活检，但对肝脏疾病的非侵入性标志物（如生物标志物和“液体活检”）仍有巨大的需求，其可以减轻诊断肝脏性疾病时对侵入性肝活检的依赖。EXOs富含细胞类型特异性蛋白、mRNA和miRNA，通过递送内容物至受体细胞而参与细胞间通信，肝细胞即是释放EXOs的供体细胞同时也是EXOs的受体，通过释放或接受不同信号通路的EXOs可以及时反映HCC、HF和肝炎的发病机理。在病毒性肝炎中，EXOs既可以以包膜的形式转运肝炎病毒，促进其复制传播、免疫逃避，导致细胞间的病毒传播，EXOs也可成为免疫治疗的靶点介导抗病毒反应，成为抗病毒或疫苗的候选物。同时，在其他肝炎症疾病，EXOs也具有巨大的潜力作为诊断和预后的生物标志物。此外，EXOs还具有逆转纤维化的能力，也可能成为促进纤维化生成的关键介质。对于HCC，EXOs的细胞间通信可能介导了血管生成，促进肿瘤的发展与转移，但其也可以作为免疫诱导剂从而抑制HCC的进展。综合以上分析可知，通过EXOs交流的机制以及特定供体细胞在EXOs中携带的信息将增进对肝脏病理生理学的了解，其作为肝病的诊断和预后分子生物标志物以及新的治疗方法具有巨大的潜力，对患者进行分层以及监测疾病的进展和治疗会成为未来重点的研究内容。因此，了解肝细胞如何通过EXOs进行交流非常重要。但目前仍然存在许多挑战，由于细胞外环境很复杂，要实现非囊泡实体与EXOs的分离并不容易，也难以跟踪EXOs在体内的产生和分配，有必要尽快建立用于纯化和分离EXOs的标准技术，用更好的标志物来评估EXOs的特异性和敏感性［71］。此外，目前对EXOs的产生、释放、靶向以及与靶细胞相互作用的机制认识也很不够，对于EXOs如何介导细胞间的信号传导仍有待于深入研究，只有阐明这一系列作用机制，将EXOs诊断和治疗应用达到标准化要求，才能更好地将之应用于临床相关疾病的诊断和治疗，服务于人类健康。