鸭NLRP3基因真核表达特性分析

伍单丹，孙迪，汪铭书，程安春，毛赛*

（1.四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川农业大学预防兽医研究所，成都 611130；3.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都 611130）

NLRP3炎症小体（Inflammasome）是一种胞浆内多蛋白复合体，是固有免疫系统重要组成，可识别多种病原相关分子模式（PAMPs）以及损伤相关分子模式（DAMPs），如外源性ATP、造孔毒素、细菌、病毒等，在机体天然免疫防御病原感染中发挥重要作用[1-3]。近年来，鸭肠炎、鸭肝炎、禽流感等病毒病及大肠杆菌病、沙门氏菌病、鸭疫等细菌病时有发生，严重威胁养鸭业健康发展。NLRP3炎症小体是炎症反应核心，在疾病发生发展中发挥关键作用，也是多种疾病治疗潜在靶点。研究表明NLRP3炎症小体可被口蹄疫病毒（FMDV）[4]、肠病毒71（EV71）[5]、新城疫病毒（NDV）[6]、脑心肌炎病毒（EMCV）[7]等多种病毒激活，引发机体炎症反应。但关于鸭NLRP3炎症小体研究较少，制约鸭NLRP3炎症小体在鸭传染性疾病中作用及机制研究，导致对水禽疾病发生机制研究及有效防治策略开发缓慢。本研究对鸭NLRP3基因克隆，通过生物信息学方法分析其氨基酸序列、蛋白质特征结构及遗传多样性，构建真核表达载体，为鸭NLRP3炎症小体功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体、细胞和抗体

真核表达载体pCAGGS为四川农业大学预防兽医研究所实验室保存。鸭胚成纤维细胞（DEF）为每次新鲜培养。ProteinFind®Anti-DYKDDDDK（Flag）Mouse Monoclonal Antibody（HT201-01）购自北京全式金生物技术有限公司；HRP标记山羊抗鼠IgG（M21001L）购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司；Alexa Fluor®488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（33206ES60）购自羿圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 主要试剂

RNAiso Plus（9108）、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase（R045A）、PrimeScript™II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A）、限制性内切酶EcoRⅠ（1611）、限制性内切酶BglⅡ（1606）、DL10000 DNA Marker（3584Q）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL5000 DNA Marker（MD102-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Endo-free Plasmid Mini KitⅡ、Plasmid Mini KitⅠ购自Omega；通用型DNA纯化回收试剂盒（DP219）购自天根生化科技（北京）有限公司；TransIntro®EL Transfection Reagent（FT201-01）购自北京全式金生物技术股份有限公司；DAPI（C0060）购自北京索莱宝科技有限公司；ECL显色液（P0018FS）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 引物设计与PCR扩增

根据NCBI鸭NLRP3基因组序列（Gene ID:101795933），利用SnapGene 2.3.2设计真核表达特异性扩增引物，送华大基因股份有限公司合成。引物序列见表1。参照RNAiso Plus（9108）说明书，从DEF细胞中提取总RNA，NanoDrop检测核酸浓度和纯度后，严格按照PrimeScript™II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A）说明书合成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增目的基因。PCR扩增体系为：PrimeSTAR®Max DNA Polymerase 5 μL，上游引物F 0.2 μL，下游引物R 0.2 μL，cDNA模板0.2 μL，ddH2O补足至10 μL。反应程序：预变性98℃3 min；98℃10 s，57℃5 s，72℃30 s，30个 循 环；72℃延伸7 min。

表1 引物设计Table 1 Primer design

1.4 载体构建及测序

PCR产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测分离，切胶纯化回收目的基因片段。同时将pCAGGS载体用限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切，回收酶切产物。将线性化载体与目的基因片段进行同源重组后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（Amp+）的LB固体平板，置于37℃培养箱过夜后挑选单菌落，进行菌落PCR鉴定。将鉴定正确的单菌落接种于Amp+LB液体培养基，继续培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒，对质粒进行双酶切鉴定并送华大基因股份有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pCAGGS-duNLRP3-Flag，-20℃保存备用。

1.5 生物信息学分析

应用NCBI数据库ORF Finder程序搜寻开放阅读框并推导氨基酸序列，BLAST比对分析基因相似性，SMART分析duNLRP3蛋白结构域；通过DNAMAN将测序结果与NCBI现有鸭NLPR3基因比对；应用DNAStar软件将测序结果与其他物种NLRP3基因序列比对同源序列，通过软件Mega X构建系统进化树；应用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL等在线软件预测分析蛋白理化性质、蛋白结构、细胞内定位等。

1.6 细胞培养与转染

参照文献原代DEF细胞分离培养方法分离、培养DEF细胞[8]。取10日龄鸭胚胚体，剔除头、四肢和内脏，用无菌PBS清洗后，将胚体剪碎成匀浆状，然后加入0.25%胰酶置于37℃水浴锅消化5 min，经4℃4 500 r·min-1离心5 min，弃上清。用DMEM重悬、过滤沉淀，将滤液与含10%NBS的DMEM混合后接种于细胞培养板，置37℃、50 mL·L-1CO2培养箱培养。待细胞汇合度达70%～80%时，将重组质粒pCAGGS-duNLRP3-Flag转染细胞。继续培养细胞，进行后续试验。

1.7 间接免疫荧光

将DEF细胞接种于含细胞爬片的12孔细胞培养板，待细胞汇合度达70%～80%时，将pCAGGSduNLRP3-Flag转染细胞，收不同时间点NLRP3样，观察pCAGGS-NLRP3-Flag表达时间。另外，在NLRP3蛋白表达之后，接毒1 000 TCID50，通过观察NLRP3荧光变化验证其生物学活性。具体操作方法：细胞爬片收样后经4 mL·L-1多聚甲醛固定、0.25%的Triton X-100透化处理后，5% BSA 37℃封闭1 h；加入一抗Anti-DYKDDDDK Mouse Monoclonal Antibody（1∶500），4℃孵育过夜；PBST洗涤后，加入Alexa Fluor®488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（1∶400），37℃孵育1 h；PBST再次洗涤后，加入DAPI（1∶1 000）染核，37℃孵育10 min；用含50%甘油封片剂封片，于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

1.8 Western blot

将DEF细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞汇合度达70%～80%时，将pCAGGS-duNLRP3-Flag转染细胞。转染48 h后，加入细胞裂解液，充分裂解后离心，收集上清，经SDS蛋白凝胶中电泳分离目标蛋白。采用半湿转方式作蛋白转膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜；TBST洗涤后，加入一抗Anti-DYKDDDDK Mouse Monoclonal Antibody（1∶5 000），4℃孵育过夜；TBST再次洗涤后，加入HRP标记山羊抗鼠IgG（1∶3 000），室温孵育1.5 h；TBST清洗后，ECL显色1 min，并采集成像。

2 结果与分析

2.1 NLRP3基因克隆

PCR扩增的NLRP3片段经10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测，经测序长度为2 901 bp，如图1所示，可在电泳图看到靠近3 000 bp位置有一条与目的片段长度相应的明亮条带，与预期长度相符。

图1 PCR扩增鸭NLRP3基因Fig.1 Amplification of duck NLRP3 gene by PCR

2.2 真核重组表达载体构建

将回收目的基因片段与pCAGGS载体同源重组连接，获得pCAGGS-duNLRP3-Flag重组质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ进行双酶切后，获得1 159、1 700和4 698 bp 3个片段，如图2所示。NLRP3序列中有一个BglⅡ酶切位点，因此，双酶切获得3个片段，与预期结果一致。经分析，确定其中含鸭NLRP3基因编码区序列全长2 805 bp（去除残留酶切位点、Flag标签和NLRP3非编码区）。

图2 重组质粒pCAGGS-duNLRP3-Flag的Eco R I和Bgl II双酶切鉴定Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid pCAGGS-duNLRP3-Flag by Eco R I and Bgl II

2.3 生物信息学分析

2.3.1 基因序列分析

将阳性重组质粒分析测序，成功获得duNLRP3基因编码区系列。应用NCBI的ORF Finder程序进行分析，结果显示，duNLRP3基因编码区全长2 805 bp，可编码934个氨基酸。通过DNAMAN将测序结果与已报道鸭NLRP3基因序列比对发现，与NCBI登 录 号 为MH373356.1、XM_005029957和XM_005029959基因序列相似性为100%，与XM_005029958基因序列相似性为90.16%，如图3所示。通过SMART程序预测结构域，结果显示，duNLRP3蛋白有NLRP3蛋白典型的结构域，分别是位于N端第7～90位氨基酸的PYRIN结构域，位于第177～345位氨基酸的NACHT结构域，以及C端的6个LRR结构域，分别位于680～707、708～735、734～764、765～793、79～822和823～849位氨基酸，如图4所示。

图3 duNLRP3与NCBI上提交的鸭NLRP3基因序列相似性分析Fig.3 Similarity analysis of NLRP3 gene sequences between the sequenced result and the sequences submitted on NCBI

图4 duNLRP3蛋白结构域预测Fig.4 Prediction of the protein domains of duNLRP3

2.3.2 相似性分析及进化树构建

应用DNAstar软件分析基因相似性，结果显示，duNLRP3基因与Gallus（鸡属）、Anser（雁属）、Numida（珠鸡属）、Tyto（草鸮属）、Centrocercus（榛鸡属）、Melegris、Coturnix（鹌鹑）、Falco（隼属）和Strigops（鸮面鹦鹉属）NLRP3基因相似性较高，分别为84.6%、75.7%、84.8%、81.5%、84.4%、84.2%、81.9%、80.3%、80.1%；与哺乳动物和鱼类NLRP3基因相似性较低，低于55%，如图5所示。系统进化树分析显示，NLRP3基因分为哺乳动物、鸟类和鱼类3个分枝，duNLRP3位于鸟类分枝，如图6所示，进化树形态与分类学保持一致。

图5 duNLRP3与其他物种NLRP3基因相似性分析Fig.5 Similarity analysis of NLRP3 gene sequences between duck and other species

图6 duNLRP3基因进化树分析Fig.6 Phylogenetic tree of duNLRP3 gene

2.3.3 蛋白质理化性质分析

应用ProtParam分析duNLRP3蛋白理化性质，结果显示，duNLRP3蛋白含有934个氨基酸，其中亮氨酸含量最高（14.9%）、谷氨酸第二（7.3%）、甘氨酸第三（7.2%），其余氨基酸含量见表2。DuNLRP3蛋白理论分子质量为104.31 ku，分子式为C4605H7310N1270O1372S59，等电点（pI）为5.88，不稳定系数为44.17，说明duNLRP3蛋白属于酸性、不稳定蛋白。

表2 duNLRP3蛋白氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of duNLRP3 protein

应用ProtScale预测duNLRP3氨基酸序列亲/疏水性，结果显示，duNLRP3氨基酸序列最低分值为-3.256（位于第98为氨基酸，谷氨酰胺），亲水性最强；最高分值为2.467（位于第840位氨基酸，丙氨酸），疏水性最强，如图7所示。该蛋白整条肽链大部分位于亲水区域，总平均亲水性（GRAVY）为-0.175，说明duNLRP3蛋白为亲水性蛋白。

图7 duNLRP3蛋白疏水性预测Fig.7 Hydrophpbicity prediction of duNLRP3 protein

2.3.4 跨膜结构域预测

通过TMHMM Server v.2.0程序预测duNLRP3跨膜结构域，结果显示，duNLRP3蛋白无跨膜区，整条肽链位于膜外且不属于定位于膜上的蛋白，为膜外蛋白（见图8）。由图9、10可知，核定位分析结果显示入核得分为0.46、信号肽预测结果显示，有信号肽概率为3.617%，表明该蛋白定位于细胞质中，属于胞质蛋白，不是膜蛋白、核内蛋白或分泌蛋白。

图8 duNLRP3蛋白跨膜结构预测Fig.8 Transmembrane structure prediction of duNLRP3 protein

图9 duNLRP3蛋白核定位预测分析Fig.9 Prediction of nuclear localization of duNLRP3 protein

图10 duNLRP3蛋白信号肽预测分析Fig.10 Prediction analysis of signal peptide of duNLRP3 protein

2.3.5 二级三级结构预测

通过SOPMA在线程序对二级结构进行预测，结果显示，duNLRP3蛋白二级结构主要为α-螺旋（58.03%），无规则卷曲、延伸链、β-转角分别为31.26%、7.07%和3.64%，如图11所示。通过SWISS-MODEL程序对该蛋白三级结构进行预测，结果显示，duNLRP3蛋白含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲等复杂结构，且duNLRP3与人NLRP3蛋白高级结构高度相似，与鱼类NLRP3蛋白高级结构存在较大差异，如图12所示。

图11 duNLRP3蛋白二级结构预测Fig.11 Secondary structure prediction of duNLRP3 protein

图12 NLRP3蛋白三级结构预测Fig.12 Tertiary structure prediction of NLRP3 protein in duck,human and Crucian carp

2.3.6 磷酸化位点预测分析

利用NetPhos3.1 Server在线程序预测duNLRP3蛋白磷酸化位点，如图13所示，结果显示，该蛋白共有81个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点47个，苏氨酸磷酸化位点27个，酪氨酸磷酸化位点7个。

图13 duNLRP3蛋白磷酸化位点预测Fig.13 Phosphorylation sites of duNLRP3 protein

2.4 重组蛋白duNLRP3-Flag表达和鉴定

IFA检测发现，重组质粒pCAGGS-duNLRP3-Flag转染DEF细胞后，鸭NLRP3蛋白从12 h开始表达，在细胞质中呈弥散性分布，且随转染时间增加蛋白表达量逐渐增多，DHAV-1刺激后，鸭NLRP3寡聚化，在核周呈现点状聚集，如图14A所示。WB检测结果显示在104 ku有条带，与预期蛋白结果相符，如图14B所示。结果表明重组质粒pCAGGS-duNLRP3-Flag可在DEF细胞中成功表达，且表达的蛋白具有寡聚化功能。

图14 重组质粒pCAGGS-duNLRP3-Flag在DEF细胞中的表达Fig.14 Expression of recombinant plasmid pCAGGS-duNLRP3-Flag in DEF cells

3 讨论

炎症小体作为炎症反应重要组成，在2002年首次被提出，是多种蛋白质组成复合体，是天然免疫系统重要组成[9]。在感知外界病原体或损伤后，传递信号给免疫系统，启动炎症。根据受体蛋白不同，炎症小体主要有NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP1、NLRP6等[10]，由于NLRP3炎症小体可被广泛外源性和内源性刺激物激活[11]，是炎症小体研究重点。NOD样受体蛋白3是NLRP3炎症小体核心蛋白，主要包含3个功能结构域：氨基（N）末端PYD结构域、中间NACHT结构域及羧基（C）末端LRR结构域[12]。本研究中扩增的鸭NLRP3基因长2 805 bp，编码934个氨基酸，具有完整PYD、NACHT和LRR结构域。因此，本试验获鸭NLRP3基因全长CDS序列，编码的蛋白在理论上具有NLRP3蛋白完整功能。研究发现，鸭NLRP3炎症小体在大肠杆菌感染及砷、钼、镉等重金属污染时参与机体炎症反应[13-16]。本研究在DHAV-1感染后，duNLRP3发生寡聚化，形成斑点样聚集。NLRP3蛋白自身寡聚化是NLRP3炎症小体活化的结构基础[17]，说明鸭NLRP3蛋白具有与哺乳动物NLRP3蛋白相似的功能。

NLRP3炎症小体激活受两级信号调控，第一级信号为预激活，第二级信号为组装。磷酸化修饰贯穿于NLRP3炎症小体激活全部过程，是预激活阶段（Priming）和组装阶段（Assembly）关键分子。在NLRP3炎症小体激活Priming阶段，位于PYD和NACHT结构域之间的第198位丝氨酸（人Ser198，小鼠Ser194）发生的磷酸化修饰介导NLRP3去泛素化及自身寡聚化，促进NLRP3炎症小体激活[18]。还有一些位点的磷酸化参与维持静息状态时NLRP3蛋白的自我抑制或抑制NLRP3炎症小体组装，抑制炎症小体激活。比如，NLRP3蛋白PYD区Ser5（小鼠Ser3）和Tyr32（小鼠Tyr30）的磷酸化导致相应位点带上负电荷，在静电斥力作用下无法与ASC蛋白PYD结构域发生同型互作，抑制炎症小体组装[19-21]。LRR区Tyr861（小鼠Tyr859）和Tyr918（小鼠Tyr915）磷酸化促进NLRP3蛋白自噬降解或蛋白酶体途径降解，在NLRP3炎症小体活性调控中发挥抑制作用[22-24]。本研究发现鸭NLRP3蛋白在上述磷酸化位点相同或相近位置也存在磷酸化阳性位点，说明NLRP3炎症小体活性调控机制在不同物种间具有相似性。

不同物种NLRP3炎症小体活性存在较大差异。相比于人类和小鼠NLRP3炎症小体的高促炎活性，蝙蝠NLRP3炎症小体促炎活性较低。在病毒感染后，蝙蝠NLRP3转录水平也显著低于人类和小鼠，Ahn等研究发现蝙蝠NLRP3蛋白LRR结构域与其较低的功能活性有关，LRR-LRR相互作用力增强，导致NLRP3炎症小体活化阈值升高，降低其促炎活性[25]。鸭NLRP3蛋白LRR结构域包含229个氨基酸，形成6个LRR。相比人NLRP3 LRR序列缩短148个氨基酸，缺失过渡LRR，并减少2个经典LRR。因此，鸭NLRP3蛋白活化能力和NLRP3炎症小体活性可能与人等哺乳动物的NLRP3炎症小体存在差异，但尚需进一步试验验证。本研究通过克隆鸭NLRP3基因全长编码区后对其进行生物信息学分析，构建鸭NLRP3基因真核表达载体，为今后探讨鸭NLRP3基因在宿主防御病原感染中作用及鸭NLRP3炎症小体功能调控奠定基础。