部分春大豆主栽品种叶绿素含量全基因组关联分析

张大勇，王象然,2，吴雨恒，赫晨宇，杨柳，贾璐，庄静而

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院佳木斯分院/国家大豆产业技术体系佳木斯综合试验站/三江平原主要作物育种栽培重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007）

大豆是我国主要油料及经济作物，富含优质植物蛋白及油脂，是食品加工及畜禽饲料重要来源[1]。其品质改善和产量提高是当代大豆育种家共同育种目标。光合作用是促使作物干物质形成主要途径，将二氧化碳和水同化并生成有机物同时释放氧气[2]。叶绿素是光合作用关键色素，对作物产量形成具有重要影响[3]。

大豆中叶绿素含量是影响光合速率重要因素，二者呈正相关趋势[4]。而光合速率与产量呈显著正相关[5]，因此叶绿素含量测定对预测和提高大豆产量至关重要。崔世友等利用151个RIL家系在4个不同生育时期下结合大豆籽粒产量分析叶绿素含量，结果发现在生育后期大豆叶绿素含量与籽粒产量呈极显著正相关[6]。张恒善利用400多份大豆品种，测定其叶绿素含量（a+b），按年度、熟期分组与产量作相关分析，结果表明各组相关程度不同，总体呈正相关趋势[7]。全基因组关联分析（Genome wide association analysis，GWAS）是目前发现复杂农艺性状基因变异的有效新策略。Rish等首次提出全基因组关联分析概念[8]，在粮食、经济、油料等作物中得到广泛运用[9]。荐红举等以588份重测序油菜种质资源为材料，连续两年测定其苗期叶绿素含量并通过全基因组关联分析最终得到23个候选基因，其中4个基因参与叶绿素合成途径，BnaA10g02050D（BnaPOR C）基因与氧化还原酶活性有关，编码原叶绿素氧化还原酶；BnaC02g01240D（BnaHEMC）基因编码胆色素原脱氨酶参与血红素生物合成；BnaC05g38600D（Bna-HEME2）基因与血红素代谢相关；BnaC09g54390D（BnaHEMG2）基因与氧化还原酶活性有关，编码原卟啉原氧化酶2[10]。史大坤等以538份玉米自交系构成的关联群体为研究对象，利用GWAS解析玉米叶绿素含量遗传基础，发现两个基因参与叶绿素代谢，GRMZM2G178859（COX10）基因参与血红素生物合成过程；GRMZM2G168858（CPR2）基因具有铁氧还蛋白还原酶型FAD结合域，编码NADPH-细胞色素p450还原酶[11]。樊庆琦等在缺铁胁迫下对小麦苗期叶片叶绿素含量进行全基因组关联分析，在对照未受胁迫条件下得到23个显著SNP位点，并认为在3B染色体上发现4个显著SNP与叶绿素合成相关[12]。

全基因组关联分析在大豆遗传分析中应用日益广泛[13]。Wen等对两个大豆群体进行基因分型共获得52 041个SNP，通过对单株荚数进行全基因组关联分析检测到1个显著相关SNP（Gm01-55794390）[14]。张友谊以224份大豆微核心种质为试验材料，对多个与产量有关性状进行全基因组关联分析，发现与产量相关联的36个基因位点[15]。

近年来，学者多利用全基因组关联分析进行大豆抗性性状及产量方面的研究，对大豆叶绿素含量遗传基础方面研究也仅限基于双亲本分离群体进行QTL定位分析[16]。由此可见，除大多数在生理生化水平上测定大豆叶绿素含量外，利用全基因组关联分析对大豆叶绿素相关基因定位研究较少。

本研究以196份国内外大豆种质资源组成的自然群体为试验材料，测定大豆叶片叶绿素含量，并结合高密度SNP标记，运用混合线性模型（Mixed linear model）作全基因组关联分析，对影响大豆叶绿素含量相关基因进行预测与筛选，为探究大豆叶绿素含量遗传机理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 田间试验方法

该群体于2021年5月种植于黑龙江省哈尔滨市东北农业大学向阳试验示范基地，每小区60行，行长3 m，行距65 cm，株距6 cm，同当地大田田间管理。

1.2.2 表型数据采集

对该自然群体每一个株行中随机选取第五片三出复叶完全展开且长势相同的连续5株，选取顶部第四片三出复叶中间小叶，利用慧诺瑞德（北京）科技有限公司多功能植物测量仪MultispeQ在其完全伸展的叶片中间部位测定SPAD值（叶绿素相对含量），重复3次，3次测量均值作为该叶片叶绿素含量；5株对应叶片叶绿素含量均值作为该品种对应叶片叶绿素含量，并用于后续表型一般统计分析和全基因组关联分析。

续表

1.2.3 数据处理与分析

利用Excel 2016对大豆自然群体叶绿素含量统计分析并剔除离群值，利用SPSS 22.0分析基因相对表达量数据并作独立样本T检验。

1.2.4 基因型鉴定

以往学者将孟子性善论理解为“孟子认为人性是善的”，实际上《孟子》一书中只说“孟子道性善”“言性善”，而后者是不能等同于“人性是善的”。如果一定要用命题表述的话，也应表述为：人皆有善性；人应当以此善性为性；人的价值和意义即在于充分扩充与实现自己的性。

材料通过Illumina HiSeqTM测序平台进行测序，流程按照Illumina公司提供标准协议执行。对获得的59 071个SNP标记按等位基因频率条件（maf）＜0.05进行质量筛选共获得52 391个高质量SNP。利用Haploview 4.2软件对质控后SNP进行连锁不平衡分析，划分单倍型块。

1.2.5 群体结构亲缘关系分析

在RStudio中采用GAPIT软件[17]对该自然群体进行群体结构、亲缘关系分析。

1.2.6 全基因组关联分析

GWAS分析在RStudio中利用GAPIT软件MLM模型作分析[17]。

1.2.7 候选基因筛选

根据大豆参考基因组，在获得叶片叶绿素含量显著关联的SNP标记上下游各100 kb内搜索基因，利用网站（https://www.soybase.org/）对所搜索到的基因进行GO分子功能注释，利用网站（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）对搜索到的基因进行KEGG途径注释，将已获得基因与拟南芥基因进行序列对比（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），进行功能注释以筛选与叶绿素含量相关的候选基因。

1.2.8 表达量分析

设计候选基因的qRT-PCR引物序列（http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb），引物序列由睿博兴科生物技术有限公司合成（见表1）。

表1 叶绿素含量相关候选基因引物Table 1 Primers of candidate genes related to chlorophyll content

根据各品种叶绿素含量，在叶绿素含量高低两类极端材料中连续选择各10个品种，选取苗期叶片提取RNA（Simgen公司UItra Pure Total RNA Extration Kit试剂盒），设置3次生物学重复。将提取的RNA反转录合成cDNA（Simgen公司cDNA第一链合成试剂盒）。使用Gene Copoeia公司BlazeTaqTM SYBR®Green qPCR Mix 2.0试剂盒进行候选基因相对表达量验证。每个样品设置3次重复，在Bio-Rad CFX96定量PCR仪上进行qRT-PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 大豆自然群体叶绿素含量表型分析

对196份大豆品种构成的自然群体，随机选取长势相同的连续5株，选取顶部第四片三出复叶的中间小叶，测定其完全伸展的叶片中间部位叶绿素含量。该自然群体绿素平均含量为49.37，含量变化范围在39.48～58.57，标准差为3.12，变异系数为6.31%，偏度值和峰度值为-0.26和0.16，并且偏度值和峰度值绝对值均小于1，说明叶绿素含量出现连续正态分布，符合多基因控制的数量性状特征，结果如图1所示。

图1 大豆自然群体叶片叶绿素含量频次分布Fig.1 Frequency distribution of chlorophyll content in leaves of soybean natural population

2.2 大豆自然群体结构评价

分析该自然群体的群体结构，PCA主成分分析结果表明该自然群体无明显分层，种质间亲缘关系均衡，从亲缘关系Kinship图也可看出，群体间无显著群体结构。选前3个主成分作协变量对群体结构进行校正，结果如图2所示。

图2 主成分和大豆遗传数据亲缘关系分析Fig.2 Principal component and kinship analyses of soybean genetic data

2.3 大豆自然群体叶绿素含量全基因组关联分析

利用GAPIT对该自然群体叶绿素含量采用MLM模型进行全基因组关联分析，并绘制Manhattan图与QQ-Plot，结果如图3所示。

图3 叶绿素含量全基因组关联分析Manhattan图与QQ-Plot Fig.3 Manhattan graph and QQ-Plot of genome wide association analysis on chlorophyll content

设P=0.5/52 391为显著关联SNP阈值，共筛选得到显著SNP共37个，分别位于2、3、4、7、10、13、16号染色体上。其中2号染色体上存在4个SNP；3号染色体上存在26个SNP；4号染色体上存在1个SNP；7号染色体上存在2个SNP；10号染色体上存在1个SNP；13号染色体上存在1个SNP；16号染色体上存在2个SNP，结合Block进行分类，结果见表2。

表2 叶绿素含量显著关联SNP位点Table 2 SNP sites significantly associated with chlorophyll content

2.4 大豆自然群体叶绿素含量候选基因预测

对阈值以上SNP位点在其上下游各100 kb范围内根据大豆基因组数据库搜索到基因194个，通过GO功能富集分析以及KEGG代谢通路富集分析，与拟南芥基因进行序列对比，根据前人研究的拟南芥同源基因功能，筛选出可能影响叶绿素含量基因11个，结果见表3。其中2号染色体1个；3号染色体2个；7号染色体3个；10号染色体3个；13号染色体1个；16号染色体1个。

表3 叶绿素含量候选基因以及注释信息Table 3 Candidate genes and annotation information for chlorophyll content

2.5 候选基因荧光定量分析

将筛选出的11个基因在叶绿素含量差异极端的两类材料中验证相对表达量，结果见表4。

表4 品种名称及叶绿素含量Table 4 Variety name and chlorophyll content

结合T检验分析结果得出4个基因Glyma.02G185300、Glyma.03G085000、Glyma.10G259900、Glyma.16G037100在两类材料中具有显著差异，结果如图4所示。

图4 大豆叶绿素含量候选基因定量分析Fig.4 Quantitative analysis of candidate genes for soybean chlorophyll content

相对于低叶绿素含量材料中，4个基因在高叶绿素含量材料中基因表达量相对较高。其中包括Glyma.10G259900编码TXND9与细胞氧化还原稳态相关，介导四吡咯生物合成并参与叶绿素合成；Glyma.02G185300编码叶绿体NTRC参与叶绿素代谢与光周期生长调控。

3 讨论与结论

叶绿素合成代谢过程十分复杂，本研究以196份国内外大豆品种组成的自然群体为试验材料，结合高密度SNP位点，对叶绿素含量进行全基因组关联分析，通过GO功能富集分析、KEGG代谢通路富集分析、基因功能注释以及qRT-PCR筛选鉴定出4个与大豆叶绿素含量相关候选基因。叶绿素属于四吡咯物质，基因Glyma.10G259900具有硫氧还蛋白结构域，编码硫氧还蛋白，存在于从胞膜到类囊体腔的所有叶绿体隔室中，介导四吡咯生物合成，直接参与叶绿素代谢[18]，这一研究结果与史大坤等研究理论相符合[11]。基因Glyma.02G185300具有硫氧还蛋白结构域，编码叶绿体NADPH硫氧还蛋白还原酶（NTRC），NTRC是一种高效氧化还原系统，为保护植物叶绿体免受氧化损伤，可控制包括叶绿素生物合成的关键代谢和调节途径，且与拟南芥光周期生长控制之间具有联系[19-20]，其他作物中与该基因功能及结构相似的相关候选基因尚未见报道。这两个基因同属于硫氧还蛋白（Trx）家族，研究表明该家族参与光合作用、叶绿素含量调控[21-22]。基因Glyma.16G037100属于肽酶M50家族，编码EGY1金属蛋白酶，是叶绿体发育必需基因，参与叶绿体发育和光合作用过程，如影响捕光复合物I和II（Lhca和Lhcb）的叶绿素a/b结合蛋白的积累，该蛋白定位在叶绿体膜、类囊体膜上参与光捕获[23]，在其他作物中与之功能及结构特征相似的相关候选基因尚未见报道。研究发现，肽酶M50家族基因具有影响叶绿体发育以及叶绿素含量的功能[24]。在3号染色体上检测到的编码细胞色素P450的基因Glyma.03G085000（CYP82C4），细胞色素P450超家族（CYP）是一大类血红素蛋白。血红素与叶绿素是具有不同金属元素的化合物，结构与特征相似。CYP通过将氧气还原为水（使用NADH或NADPH）催化有机物质氧化，并与金属摄取/转运密切相关[25]，这一结果与史大坤等在玉米中研究结果与叶绿素相关基因功能相似[11]，有研究表明该基因家族在叶绿素含量调控方面发挥作用[26-27]。本研究利用全基因组关联分析对影响大豆叶绿素含量基因进行预测，为探究大豆叶绿素含量遗传机理提供理论参考。为进一步探究与大豆叶绿素含量相关候选基因，后期将对候选基因功能进行有效验证，为大豆分子育种提供有效依据。