赵宏圻 斯向东
恶性黑色素瘤主要发生于皮肤、黏膜或色素膜[1]。近年来,恶性黑色素瘤发病率和病死率不断增长,严重威胁人们的生活质量及生命健康,引起广泛关注[2]。恶性黑色素瘤早期症状不典型,多数患者确诊时已属晚期[3-4],因此,寻找有效且精确的诊断和治疗方法对提高恶性黑色素瘤患者生存质量及延长患者生存期十分关键。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由18~25个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA,可降解靶信使RNA或抑制转录后翻译,调控基因表达。研究证实,miRNA-186和miRNA-146a在多种恶性肿瘤中异常表达,且发挥重要作用[5-6],但目前关于miRNA-186和miRNA-146a表达水平与恶性黑色素瘤的关系研究较少,缺乏可靠的临床参考依据。本研究收集恶性黑色素瘤患者肿瘤组织及瘤旁组织标本,检测并分析恶性黑色素瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a表达水平及与患者病理特征和预后的关系,以期为恶性黑色素瘤的诊断和治疗提供参考。
1.1 对象 收集2017年1月—2021年1月浙江金华广福肿瘤医院行手术切除的93例恶性黑色素瘤患者的肿瘤组织及瘤旁组织。纳入标准:(1)病理学证实为恶性黑色素瘤;(2)≥18岁;(3)具有完整的临床资料;(4)具有完整的随访资料;(5)未经放化疗。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤者;(2)失访者;(3)临床资料不全者;(4)肝、肾、心、肺功能严重异常者;(5)严重精神疾病者;(6)手术禁忌者;(7)妊娠或哺乳期妇女。纳入的93例患者中,男56例,女37例;年龄32~75(56.61±8.29)岁。
1.2 主要试剂与仪器 TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司(批号:15596018),逆转录试剂盒购自美国Biomiga公司(批号:K1622)。使用的Roche LightCycler 480实时PCR系统购自美国Applied Biosystems公司。
1.3 方法 采用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定miRNA-186和miRNA-146a表达;取患者肿瘤组织和瘤旁组织剪碎并研磨,采用TRIzol试剂提取组织中总RNA,取1 μl RNA溶液紫外光分度计测定吸光度(OD)260/OD280和纯度,取5 μl总RNA进行琼脂糖凝胶电泳并检测总RNA的纯度和完整度。按照逆转录试剂盒使用说明书将其逆转录为cDNA,以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,检测miRNA-186和miRNA-146a表达。取cDNA进行qRT-PCR。miRNA-186引物序列:正向引物5'-CCCGATAAAGCTAGATAACC-3',反向引物 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';miRNA-146a引物序列:正向引物5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3',反向引物5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3'。反应体系:SYBR Green I Master 10.0 μl,正向引物 1.0 μl,反向 引 物1.0 μl,DNA 模板 2.0 μl,RNase-Free H2O 8.5 μl。反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃ 15 s、60℃ 1 min,40个循环。每个样品设置3个复孔。引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法计算miRNA-186和miRNA-146a相对表达量。
1.4 预后评价 随访至2022年1月,评估患者预后情况,主要采取门诊复诊、电话、微信、上门随访等多种方式进行。
1.5 观察指标 (1)比较肿瘤组织与瘤旁组织miRNA-186和miRNA-146a相对表达量;(2)比较不同病理特征患者肿瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量;(3)比较不同预后情况患者肿瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量。
1.6 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以±s表示,两组间比较采用近似t检验,多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以频数表示,组间比较采用χ2检验。采用多因素logistic回归分析影响恶性黑色素瘤患者预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 肿瘤组织与瘤旁组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量比较 肿瘤组织miRNA-186相对表达量高于癌旁组织,miRNA-146a相对表达量低于癌旁组织(P<0.01),见表1。
表1 肿瘤组织与瘤旁组织miRNA-186和miRNA-146a相对表达量比较
2.2 不同病理特征患者肿瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量的比较 不同性别、年龄、肿瘤部位和Clark分级患者肿瘤组织中miRNA-186相对表达量比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。Ⅳ期患者肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于Ⅱ期和Ⅲ期患者,淋巴结转移患者肿瘤组中miRNA-186相对表达量高于无淋巴结转移患者(均P<0.05);不同性别、年龄、肿瘤部位和Clark分级患者肿瘤组织中miRNA-146a相对表达量比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);Ⅳ期患者肿瘤组织中miRNA-146a相对表达量低于Ⅱ期和Ⅲ期患者,淋巴结转移患者肿瘤组织中miRNA-146a相对表达量低于无淋巴结转移患者(均P<0.05),见表2。
表2 不同病理特征患者肿瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量的比较
2.3 不同预后情况患者肿瘤组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量的比较 随访至2022年1月,93例恶性黑色素瘤患者中生存74例,死亡19例。死亡组肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于生存组,miRNA-146a相对表达量低于生存组(均P<0.05),见表3。
表3 不同预后情况患者癌组织中miRNA-186和miRNA-146a相对表达量的比较
2.4 影响恶性黑色素瘤患者预后的危险因素分析多因素logistic回归分析显示,临床分期、淋巴结转移、miRNA-186表达和miRNA-146a表达是影响恶性黑色素瘤患者预后的危险因素,见表4。
表4 影响恶性黑色素瘤患者预后的危险因素
目前,恶性黑色素瘤的具体发病原因尚未完全阐明[7-10]。恶性黑色素瘤早期症状不典型,多数患者未引起重视及及时就诊,确诊时错失了最佳根治时机;恶性黑色素瘤晚期转移早、发展迅速、预后较差,传统治疗效果不理想,且病死率高等[11-13]。
miRNA由基因组DNA编码,在RNA聚合酶Ⅱ作用下被转录,参与调节靶基因,并在细胞代谢、增殖、凋亡等生理及病理过程中发挥重要作用,参与调控癌基因和抑癌基因的表达,与肿瘤的发生、发展关系紧密[14-15]。近年来,miRNA在肿瘤诊断上的作用及肿瘤基因治疗方法研究成为热点[16-18]。恶性肿瘤是多基因异常的一种疾病,由于原癌基因表达激活或抑癌基因突变缺失,使细胞逃逸正常生长调控机制,导致无限增殖和侵袭。研究证实某些miRNA在肿瘤中异常表达,可刺激肿瘤增殖、侵袭转移及血管生成[19]。miRNA-186位于1P31.1染色体上,是一种与肿瘤发生密切相关的微小RNA[20]。刘冲等[21]发现,相比健康人群和慢性肝炎患者,肝细胞性肝癌患者血清miRNA-186相对表达量较高,利用miRNA-186表达水平诊断肝癌的灵敏度达78.18%,特异度达63.64%,推测miRNA-186可能是肝癌标志基因。miRNA-146a在多种肿瘤增殖、生长及侵袭转移中作为抑癌基因还是癌基因尚无明确定论[22]。陈霖霖等[23]发现,甲状腺乳头状癌患者miRNA-146a表达低于甲状腺结节患者,且与肿瘤长径>2 cm、临床分期Ⅲ期、有包膜侵犯及有淋巴结转移等病理特征密切相关。本研究发现,恶性黑素瘤患者肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于瘤旁组织,而miRNA-146a相对表达量却低于瘤旁组织,可见恶性黑色素瘤患者miRNA-186高表达而miRNA-146a低表达;Ⅳ期患者肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于Ⅱ期和Ⅲ期患者,而miRNA-146a相对表达量低于Ⅱ期和Ⅲ期患者,淋巴结转移患者肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于无淋巴结转移患者,而miRNA-146a相对表达量低于无淋巴结转移患者,可见恶性黑色素瘤患者miRNA-186和miRNA-146a异常表达与临床分期、淋巴结转移密切相关;死亡组肿瘤组织中miRNA-186相对表达量高于生存组,而miRNA-146a相对表达量低于生存组,可见恶性黑色素瘤患者miRNA-186和miRNA-146a异常表达与预后密切相关。
综上所述,恶性黑色素瘤组织中miRNA-186高表达,而miRNA-146a低表达,且与临床分期、淋巴结转移和预后密切相关。