miR-21、ILK 及Bax 蛋白在CIN 中的表达及临床意义

董芮 赵琳 董琴 管业秋 徐爱芳

宫颈癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，有着较高的病死率［1］。近些年来该病患病率持续升高且趋于年轻化，对社会造成沉重的压力［2］。据报道，宫颈癌的发生与宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）有一定关联［3］。CIN主要由于人类乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）对女性生殖器的持续性感染外所致。目前，医学研究员致力于寻找更有效的指标对CIN进行早期诊断，以缓解宫颈浸润速度［4］。严晓春等学者［5］研究显示内源性非编码RNA 对肿瘤细胞的增殖有一定刺激作用。随着对肿瘤细胞的深入研究，多数学者认为促凋亡基因与诱导肿瘤细胞凋亡有明显相关性［6］。综合上述观点，本文推测促凋亡基因、内源性非编码RNA 对CIN 病变细胞死亡有一定影响。故本文展开对微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）、整合素连接激酶（Integrin-Linked Kinase，ILK）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 Assaciated X protein，Bax）三种相关因子进行研究，探寻其表达水平对CIN 的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2020 年1 月至2022 年10 月苏州科技城医院收诊并治疗的63 例宫颈上皮内瘤变患者纳入CIN组进行研究，选择同期84 名健康志愿者纳入对照组进行研究。所有研究对象均为女性，其中CIN 组平均年龄（46.72±5.13）岁；对照组平均年龄（47.03±5.10）岁。两组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。

CIN 纳入标准：①符合《子宫颈上皮内瘤变或原位腺癌的处理》［7］标准；②既往无化疗史及大型手术治疗史；排除标准：①既往有CC 治疗史患者；②未签署知情同意书患者；③合并其他肿瘤患者。本研究经医学伦理委员会通过，受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

采集两组受试者宫颈组织，对宫颈表面进行清洁后将宫颈窥探器置入宫颈表面旋转，并将宫颈刷上宫颈组织制成病理标本；采集两组受试者外周静脉血5 mL，对血液样本进离心处理（2 800 r/min 离心半径8 cm，10 min）后取血浆保存至-60℃环境中，采用RNA 试剂盒（规格：MA-6000，苏州雅睿生物技术有限公司，国械注准20173401410）对血浆中总RNA 进行提取，并通过反转录试剂（规格：48T，深圳市晋百慧生物有限公司，国械注准20183400108）制成cDNA，再由荧光定量PCR 测定仪（型号：RTQ-960，艾康生物技术（杭州）有限公司，国械注准20134524139）在高温下进行变性、循环等操作，最终用2-ΔΔCT计算机体组织的miR-21 的相对表达量。联合ILK 试剂盒（规格；96T，上海晶抗生物工程有限公司，国械注准20167438241）、Bax 试剂盒（规格：96T，广州万孚生物技术股份有限公司，粤穗械备20191982 号）及细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显色试剂盒［规格：2×3 mL，罗氏诊断产品（上海）有限公司，国械备20161582 号］，根据试剂盒说明书对宫颈组织进行常规免疫组化检验，用PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。所有切片均在相同条件下进行。

结果判定［8］：ILK 及Bax 阳性表现为细胞质中出现棕黄色颗粒。在高倍显微镜下随机对5 个视野进行查看，单个视野中选200 个细胞进行计数，根据阳性细胞所占百分比对结果进行计分，0 分：细胞占比＜5%，1 分：5～25%，2 分：26～50%，3 分：51%～75%，4 分：＞75%；再根据阳性细胞着色程度进行计分，1 分：呈淡黄色，2 分：呈黄色，3 分：呈黄棕色。最终阳性强度为阳性细胞所占百分计分与阳性细胞着色程度的乘积，阴性：-，0 分，弱阳性：+，1～4 分，阳性：++，5～12 分，强阳性：+++，＞12 分，采用≥++率表示阳性表达率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件分析数据，计量资料采用（±s）的形式表示，组间比较采用t检验；计数资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-21 表达比较

CIN 组miR-21相对表达量（2.57±0.82）高于对照组（1.03±0.14），差异有统计学意义（t=16.906，P＜0.05）。

2.2 两组Bax 表达比较

CIN 组Bax 蛋白阳性率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 Bax 蛋白在各组宫颈组织中的表达［n（%）］Table 1 Expression of Bax protein in cervical tissues of each group［n（%）］

2.3 两组ILK 表达比较

CIN 组ILK 阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 ILK 在各组宫颈组织中的表达［n（%）］Table 2 Expression of ILK in cervical tissues of each group［n（%）］

2.4 宫颈组织中miR-21、ILK 及Bax 蛋白阳性表达与病理特征的关系

不同年龄阶段、不同组织类型的miR-21、Bax蛋白、ILK 阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而CIN 分级越高，宫颈组织中ILK 阳性率高，Bax 阳性率越低，miR-21 相对量越多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 宫颈组织中miR-21、ILK 及Bax 蛋白水平表达与病理特征的关系［n（%），（±s）］Table 3 Relationship between expression of miR-21，ILK and Bax proteins and pathological features in cervical tissues［n（%），（±s）］

表3 宫颈组织中miR-21、ILK 及Bax 蛋白水平表达与病理特征的关系［n（%），（±s）］Table 3 Relationship between expression of miR-21，ILK and Bax proteins and pathological features in cervical tissues［n（%），（±s）］

组别年龄n ILK Bax 蛋白阳性11（29.73）9（34.62）4（13.79）16（47.06）17（31.48）3（37.50）χ2χ2χ2 P 值0.6820.033＜40≥40Ⅰ～Ⅱ级Ⅲ级P 值0.8560.642 0.168 P 值0.523 CIN 分级0.005 7.99311.5330.0012.3560.027组织类型 高级别鳞状上皮低级别鳞状上皮37 26 29 34 54 8 0.1160.734阳性25（67.57）17（65.38）13（44.83）29（85.29）38（70.37）4（50.00）1.3230.690 miR-21相对表达量4.37±1.24 4.58±1.33 4.03±1.16 4.89±1.74 4.12±1.20 4.48±1.620.7560.452

3 讨论

近些年来，宫颈癌患病人群呈上升趋势，研究学者力求寻找更有效的治疗方案，进一步对宫颈癌相关病理机制及其癌前病变进展情况进行探究。研究发现CIN 病变细胞的分化、凋亡与细胞间信息传递有密切关系［9］。因而阻断病变细胞信号传导并诱导病变细胞凋亡成为了CIN 治疗的新方向。

大量研究显示，miR-21 能促进肿瘤细胞的增殖和分化，对肿瘤细胞的凋亡有抑制作用［10］。韩宁［11］对154 例宫颈癌患者进行研究发现，宫颈癌组织中miR-21 的相对表达量较高。而许娟秀［12］对CIN 患者深入探究后提出，miR-21 在CIN 患者等宫颈组织中也有较高的表达。上述研究与本文对CIN 患者探究后得出的结果一致。由此猜测miR-21 可能通过识别病变细胞的脆性定位点，削弱mRNA 对病变细胞基因的调控作用，进而抑制病变细胞的凋亡，加速CIN 的发展。同时李允利等［13］在研究中提出miR-21 可能具有致癌基因的功效。但目前对于该论点的相关文献较少，需对此进一步研究证实。

王秀灵等［14］通过上调肿瘤患者体内Bax 蛋白，发现其化疗效果得到有效提高，分析推测Bax蛋白增加了机体对化疗的敏感度。本文同样对Bax 蛋白深入研究，结果显示CIN 组Bax 蛋白阳性率显著低于对照组，此结果与孔佑虔［15］一致。Bax蛋白是一种促进细胞凋亡的因子，在机体内以二聚体的形式诱导病变细胞死亡，同时抑制B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的抗凋亡作用，推进病变细胞的凋亡，抑制癌前病变的发展，曾永蕾等［16］也曾推测Bax 蛋白可逐渐发展成为癌变的预测因子。

ILK 因子是一种新型信号导转因子，能提高激活蛋白（Activator Protein 1，AP-1）的活性，进而对基因表达进行调控。ILK 在CIN 患者体内能有效抑制病变细胞凋亡，提高细胞间的信号传导，进而增强病变细胞的侵袭能力，推动宫颈组织的恶化，致使CIN 向浸润癌发展。Godínez 等［17］科研学者通过将ILK 阳性细胞植入实验鼠体内，观察到实验鼠随着植入细胞的生长，其正常细胞逐渐发展成为恶性肿瘤细胞。而本文对ILK 展开研究，结果显示CIN 组患者宫颈组织中ILK 呈现高表达，与吴雪艳等［18］研究结果相符。进一步对miR-21、ILK、Bax 研究可知，不同年龄阶段、不同组织类型的miR-21、Bax 蛋白、ILK 阳性表达率比较差异无统计学意义；而CIN 分级越高，宫颈组织中ILK 阳性率高，Bax 阳性率越低，miR-21 相对量越多。但此结论与李晓丹［19］研究得出的观点存在较大差异，推测其可能原因为本研究样本不足，导致组间对比不充分，同时本文未对miR-21、ILK、Bax 蛋白因子间相互影响进行分析，导致研究结果受到干扰，因此需再深入研究证实。

综上，miR-21、ILK 在CIN 患者宫颈组织中呈现高表达，Bax 蛋白呈现低表达，而miR-21、ILK、Bax 蛋白水平与CIN 病变细胞的凋亡有密切关联。