不同基因型的香蕉叶片结构与褐缘灰斑病发生的相关性研究

殷晓敏 连子豪 刘永霞 王丽霞 陈弟 何应对

（中国热带农业科学院海口实验站/海南省香蕉遗传改良重点实验室 海南海口 571101）

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（MusaL.）单子叶植物，脉序为横出平行脉，侧脉与中脉近乎垂直，而侧脉之间近于平行，该叶片类型有利于病原菌的侵入与扩展蔓延，使得香蕉褐缘灰斑病（Sigatoka diasease of banana）成为一种常发性重要病害[1]，并且在全球范围内流行危害[2]，其病原致病菌为香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）[2]。香蕉在抽穗期间至少要保存有7～8片青绿无病的功能叶片，在采收时仍保存有4～5片功能叶片，才能获得预期的产量和保证的果实质量[3]。在海南5—10月高温多雨季节病害盛发，受害叶片面积常占叶片总面积的20%～60%，造成产量大减、果实品质下降，严重时减产50%以上，同时造成农药使用量剧增，环境污染加剧[3]。

香蕉的完全叶片由叶鞘、叶柄和叶片组成，叶片内部组织结构组成为表皮，叶肉和叶脉，叶肉组织由栅栏组织和海绵组织组成。在表皮细胞覆有角质层和气孔，气孔以一定间隔散布于整个叶片，表皮气孔是气体交换与水分蒸腾的主要通道，同时也是植物病原菌侵染植物的重要通道。关于叶片气孔密度、气孔形态特征与病害抗性关系在脐橙[4-5]、柑橘[6]、桉树[7]、杨树[8]、大豆[9]、蚕豆[10]、黄瓜[11]等作物上有相关报道。关于叶片组织结构与抗病性关系在苹果[12]、猕猴桃[13]、木薯[14]、桉树[15]、油桐[16]、大豆[17]、向日葵[18]、苦瓜[19]等作物上开展过相关的研究。各报道得出植物对病原菌的抗性取决于叶片气孔的多少及解剖结构，但是气孔与抗病性之间的关系，不同作物和不同病害的研究之间结论各异，无关或密切相关[20]。鉴于不同基因型香蕉受叶斑病危害程度不同，而对于香蕉气孔、叶片组织结构与病害发生的相关性尚未见报道，本研究以不同基因型香蕉种类为研究对象，通过叶片气孔和形态学结构特征的比较，分析其与病情指数的相关性，以期寻找抗性鉴定初选指标，为筛选抗病品种（系）节约时间和成本，为选育优质抗病新型香蕉品种（系）提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

于2021年5月在海南省儋州市宝岛新村红洋队基地（N 19°53′30″，E 110°04′52″）开展试验。土壤质地为砖红壤土，pH 4.40，有机质14.4 g/kg，全氮0.053%，全磷929.91 mg/kg，全钾3.29%，碱解氮156.60 mg/kg，有效磷200.10 mg/kg，速效钾332 mg/kg。气候条件为热带湿润季风气候，年平均气温为23.5℃，光热充足年，年均光照时数在2 100 h以上。雨量适中，年均降雨量1 800 mm，5—10月为雨季，占年雨量的80%，为香蕉褐缘灰斑病高发病期。

以贡蕉（Musaspp.，AA）的海贡蕉、HKXJ-1品种（系），香芽蕉（Musa acuminataL. Cavendish subgroup，AAA）的巴西蕉、红香蕉品种，大蕉（Musa paradisiacaL.，AAB）的东莞中把大蕉、东莞高把大蕉品种，粉蕉（Musaspp. PisangAwak subgroup，ABB）的广粉1号、西贡蕉品种，共计4种基因型8个品种（系）为供试材料，其中，HKXJ-1为香蕉供试品系，其余7个为香蕉供试品种。

香蕉褐缘灰斑病致病菌香蕉生球腔菌（Mycosphaerella musicolaJ. L. Mulder.）为本课题组田间自然分离保存。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 在香蕉抽蕾期，以不同的品种（系）设定8个区组试验，每小区随机调查20株，单株为试验重复，每株从顶叶向下调查10片叶，以香蕉褐缘灰斑病菌喷雾接种侵染为田间鉴定对象，记录调查的总叶片数、病叶数及病级，统计

发病率，计算病情指数[21]。病情分级标准为[22]0级，无病斑；1级，病斑面积占整叶面积的5%以下；3级，病斑面积占整叶面积的6%～15%；5级,病斑面积占整叶面积的16%～25%；7级，病斑面积占整叶面积的26%～50%；9级，病斑面积占整叶面积的50%以上。

1.2.2 组织观察 叶片气孔形态和气孔密度的观察和测定 在香蕉抽蕾期，取材方向尽量一致，从上至下第3个叶片，3次重复。采用 IAA 固定液固定后置于冰醋酸与过氧化氢各半的离析液中离析24～48 h，离析后分上、下表皮制片观察。气孔密度为在正置显微镜（NI/E）10倍镜下14～16个视野气孔数之和的每视野平均数[10]。计算叶片背面和腹面气孔密度，测定气孔长度、宽度及保卫细胞长度、宽度。

叶片组织结构的观察和测定 用灭菌刀片切取大小为3 mm×6 mm叶片组织块，用镊子将其放入装有清水的培养皿中，作为切片材料备用；采用改进后的徒手切片法[23]，利用手摇式冷冻超薄切片机（CM1950）将试验材料置于冰台上进行切片。在正置显微镜（NI/E）下观察叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、背部和腹部表皮厚度及角质层厚度。

1.2.3 数据分析 利用Excel 2010软件进行数据统计分析，SPSS 23.0软件进行方差多重比较分析，以及病情指数与气孔密度、组织结构的相关性分析[9,12]。

2 结果与分析

2.1 香蕉叶片组织结构形态学观察

2.1.1 气孔形态学的观察 气孔是气体交换与水分蒸腾的主要通道，也是植物病原菌侵染植物的重要通道。从横切片来看，气孔以一定间隔分散于叶片腹部表皮和背部表皮，是由两个半月形保卫细胞构成，保卫细胞在气孔两侧中央膨胀。不同品种的病情指数、背部气孔密度（个/mm2）、腹部气孔密度（个/mm2）、气孔长度（μm）、气孔宽度（μm）和保卫细胞宽度（μm）差异显著（表1）。其中病情指数较低的是红香蕉和广粉1号，分别为7.05和8.09，较为抗病；其次是HKXJ-1和西贡蕉，病情指数分别是12.15和13.43，较为耐病。病情指数较高的为东莞高把大蕉和巴西蕉，分别是30.97和31.32，较为感病。病情指数越低抗病性越强，抗病性从高到底依次为红香蕉>广粉1号>HKXJ-1>西贡蕉>东莞中把大蕉>海贡蕉>东莞高把大蕉>巴西蕉。叶片背部气孔密度最大是红香蕉，为328.45个/mm2，其次是HKXJ-1，为298.93个/mm2，再次是东莞中把大蕉和巴西蕉，分别为203.51和114.23个/mm2。叶片腹部气孔密度最大是红香蕉，为98.75个/mm2；其次为西贡蕉和HKXJ-1，分别为72.88和70.37个/mm2；再次为东莞中把大蕉，为12.00个/mm2。气孔宽度最大是HKXJ-1，为16.56 μm；其次为红香蕉和东莞中把大蕉，分别为15.87和15.74 μm；最小是东莞高把大蕉，为13.46 μm。保卫细胞宽度最大是西贡蕉，为33.49 μm；其次是HKXJ-1和海贡蕉，分别为31.58和30.75 μm；最小在红香蕉，为24.67 μm。

表1 香蕉不同品种的叶片气孔形态学指标

2.1.2 叶片组织结构的测定 不同品种叶肉组织间的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度差异显著（表2）。在叶片背部一侧有海绵组织，为数层球状或不规则的细胞稀疏连接，细胞间隙充分发达，在外部与气孔相通，呼吸时进行气体交换。海绵组织厚度最大值在广粉1号，为268.97 μm；其次是HKXJ-1和红香蕉，分别为236.53和223.41 μm；最小在巴西蕉，为134.14 μm。在叶片腹面一侧具有栅栏组织，为1层细胞，表面呈直角柱状细胞，彼此稍微紧密相连，细胞间隙比较狭小，叶片栅栏组织细胞发达，能够扩大细胞表面积，扩大与阳光及空气接触面积，其光合作用效能也越大。栅栏组织厚度最大值广粉1号，为63.82 μm；其次在西贡蕉东莞中把大蕉和HKXJ-1，分别为48.54和40.49 μm；最小在海贡蕉，为19.39 μm。叶片厚度最大是红香蕉，为359.57 μm；其次为广粉1号和HKXJ-1；分别为303.5和294.07 μm；最小在西贡蕉，为215.79 μm。

表2 香蕉不同品种的叶片组织结构学指标

2.2 香蕉叶片结构形态学与病情指数的相关性分析

2.2.1 气孔形态与病情指数相关性分析 用SPSS 23.0对病情指数、叶片气孔形态各项指标进行相关分析，得出各数据间的相关系数矩阵（表3）.结果表明，病情指数与气孔密度、气孔形态各项指标的相关程度依次为背面气孔密度>腹面气孔密度>气孔宽度>保卫细胞宽度>气孔长度>保卫细胞长度。其中，气孔各形态指标间存在极显著正相关，气孔长度与保卫细胞长度、气孔宽度的相关系数分别为0.567和0.412。病情指数与气孔长度、气孔宽度、保卫细胞长度和保卫细胞宽度相关性不显著，而病情指数与叶片背面气孔密度、腹面气孔密度呈极显著负相关，相关系数分别为–0.874和–0.757。另外，背面气孔密度和腹面气孔密度间呈极显著正相关，相关系数为0.891，表明同一品种背面气孔密度越多，腹面气孔密度随之增加，表明叶片气孔密度越大，病情指数越低，抗病性越强。叶片腹面气孔密度、背面气孔密度可作为香蕉种质抗病性鉴定的初选指标。结合植株病情指数鉴定结果得出，红香蕉抗病性最强，广粉1号次之，巴西蕉抗病性最弱，抗病性顺序依次为红香蕉>广粉1号>HKXJ-13>西贡蕉>东莞中把大蕉>海贡蕉>东莞高把大蕉>巴西蕉。

表3 香蕉叶片气孔形态与病情指数的相关性

2.2.2 组织结构与病情指数相关性分析 用SPSS 23.0对病情指数、叶片组织结构各项指标进行相关性分析，得出各数据间的相关系数矩阵（表4）。结果表明，病情指数与叶片组织结构各项指标的相关程度依次为海绵组织厚度>叶片厚度>栅栏组织厚度>背部皮层厚度>腹部皮层厚度>角质层厚度。其中病情指数与栅栏组织厚度、背部皮层厚度、腹部皮层厚度、角质层厚度相关性不显著，而与叶片厚度、海绵组织厚度呈极显著负相关，相关系数分别为–0.544和–0.591。另外，叶片厚度与海绵组织厚度间呈极显著正相关，相关系数为0.550，表明海绵组织厚度和叶片厚度数值越高，病情指数越低，抗病性越强。因此抗病性最强分别为广粉1号、HKXJ-1及红香蕉。叶片厚度和海绵组织厚度也可作为香蕉种质抗病性鉴定的辅助参考指标。

表4 香蕉叶片组织结构与病情指数的相关性

3 讨论与结论

3.1 讨论

香蕉叶片扁平、薄而宽，由叶片、叶柄和叶鞘组成完全叶，叶片长达2 m以上，为巨大叶型，有地下茎长出的叶鞘，形成彼此重叠的地上茎。气孔以一定间隔散布于整个叶片，一般是50～300个/mm2[24]。本研究发现，不同香蕉基因型叶片腹部气孔密度为12～98个/mm2，背部气孔密度为114～328个/mm2（表1），表明不同基因型香蕉种类叶片气孔密度分布均较多，这一研究结果与旱地和湿地植物气孔分布较少，中生植物气孔分布较多的报道相一致[24]。关于气孔密度与植物抗病性的相关性，许多学者持有不同的观点。杨树对黑斑病的抗病性[8]和华山松对疱锈病的抗病性研究[25]认为，气孔密度与抗病性不存在相关性。有研究结果指出，气孔密度与抗病性呈负相关，如大豆对灰斑病抗性[9]、蚕豆对锈病抗病[10]和黄瓜对霜霉病抗[11]，表明抗病品种提供菌丝从气孔侵入的机会少，也是抗病品种抵抗病菌侵入的第一结构屏障。也有研究表明，猕猴桃叶片气孔密度与溃疡病抗性成正相关[13]，这一研究结果与本研究结果一致，叶片气孔密度与不同基因型香蕉种类抗病性呈正相关，即气孔密度越大，病情指数越低，抗病性越强。不同基因型香蕉种类病原菌侵染位置有所不同，香蕉背部气孔密度显著多于腹部表皮气孔密度，其背部气孔密度大优点在于既利于减少叶片蒸腾作用，又利于气体交换，这与蚕豆、桉树叶片气孔密度分布特点一致[7，10]，也契合了关于香蕉褐缘灰斑病在叶片病斑腹面产孢丰盛的报道[3]。

叶斑病潜育期较长（1～2月），最长的可达115 d，较老的叶片不容易受到侵染，第3片或第4片叶上看到的病痕，其实是它们刚展开时受到侵染的结果[3]。有报道指出，病原菌直接穿透寄主组织时，角质层起到增强抗病性的作用[14]。本研究指出，叶片角质层厚度与抗病性相关性不显著，与木薯[14]的研究结果相一致；但海绵组织厚度与抗病性相关性不显著，与木薯对细菌性枯萎病抗性[14]的研究结果不同。本研究结果表明，叶片厚度与海绵组织厚度相关性极显著，因此，叶肉组织结构与香蕉叶片叶斑病抗性的关系有待进一步研究。

本研究以不同基因型香蕉种类为研究对象，通过叶片结构特征比较，分析其与香蕉叶斑病抗病相关性。叶片背部气孔密度增加，病情指数降低，抗病性增强。叶片海绵组织厚度和叶片厚度数值越高，病情指数越低，抗病性越强。综上所述，结合病情指数田间鉴定结果，香蕉抗病性鉴定顺序依次为红香蕉>广粉1号>HKXJ-1>西贡蕉>东莞中把大蕉>海贡蕉>东莞高把大蕉>巴西蕉。

3.2 结论

不同基因型香蕉叶片结构特征存在着抗叶斑病的差异，叶片腹面气孔密度、背面气孔密度可作为叶斑病抗性的初步鉴定参考标准，叶片厚度、海绵组织厚度可作为抗病性鉴定的辅助参考指标，为高抗品种的引种栽培，以及选育优质抗病新型香蕉品种（系）提供依据，同时将为筛选抗病品种节约大量的时间和成本。