基于网络药理学和分子对接探讨通关藤治疗胃癌的作用机制

覃 薇, 殷梓辛, 华维维, 王玉洁, 王 杨,邓嘉林, 蔡曌颖, 钱亚云, 2

(1. 扬州大学转化医学院, 江苏 扬州, 225001;2. 国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室, 江苏 扬州, 225001)

胃癌(GC)[1]为全球发病率最高的消化道恶性肿瘤之一，早期症状难以察觉，多数患者确诊时已发现转移病灶甚至进展为晚期。胃癌的治疗主要依赖化疗和放疗，但肿瘤细胞的耐药性以及化疗的毒副作用会严重影响治疗效果，降低患者生活质量[2]。现代药理学研究[3-4]表明，中药联合用药治疗肿瘤可提高放化疗的有效性，减轻副作用，调节免疫力，很大程度上提高肿瘤患者生存质量。通关藤[Marsdeniatenacissima(Roxb.)Wight et Arn.,MT]又称乌骨藤，主要产于中国云南省，味苦，微寒，归肺经，具有止咳平喘、祛痰、清热解毒的功效[5]。现代中药研究[6]中, MT被证实具有抗癌、平喘、抑菌、保肝、利尿及免疫调节的作用，其制剂消癌平注射液已被广泛应用于临床，并取得良好治疗效果。本研究探讨MT的具体抗癌活性物质及分子作用机制，以期更好地指导临床用药。

1 资料与方法

1.1 MT的活性成分与靶点筛选

在Pubmed、知网数据库等中英文检索平台输入关键词“通关藤” “乌骨藤”“Marsdeniatenacissima”, 获取通关藤相关活性成分，并通过Chemical Book、化学专业数据库、化源网分别对活性成分相关信息、化合物结构、CAS号进行补充及筛选，用PubChem确认活性成分的结构及名称，得到通关藤候选活性成分。Swiss ADME中，化合物符合Lipinski[21]、Ghose[22]、Veber[23]、Egan[24]、Muegge[25]中2种及以上的类药性原则，则被视为具有较好的成药潜力; 肠胃吸收(gatrointestinal absortion, GI absortion) 结果为“High”[26], 则表示该化合物具有较好的口服生物利用度。以同时具有较好成药潜力及口服生物利用度为标准[27], 筛选出MT有效活性成分。将MT有效活性成分SMILES格式文件分别导入Swiss Target Prediction数据库，每个活性成分取前100个“probability”值大于0的潜在作用靶点，汇总后得到MT活性成分靶点，使用Uniprot数据库统一规范为基因名。资料收集与处理使用的网站及数据库见表1。

表1 网站及数据库汇总

1.2 GC相关靶点搜集及共同靶点获取

在DrugBank、OMIM、TTD、GeneCards等数据库检索关键词“gastric cancer”, 得到GC相关靶点，并采用Uniprot规范为基因名。将MT与GC基因名取交集后得到交集基因，由Cytoscape构建可视化“药物-成分-靶点-疾病”网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及核心基因筛选

将交集基因导入String，以Interaction score>0.9筛选交集基因，并剔除游离基因，得到关键基因，作PPI网络，导出为tsv(*. tsv)文件并使用Cytoscape打开，构建可视化网络图，使用MCC算法筛选前10个核心基因(Hub Gene)。

1.4 分子对接

为了验证Hub Gene，本研究通过分子对接技术来探讨活性成分与基因蛋白的相互结合作用。MT关键成分中, Kaempferol及Caffeic acid已有大量抗肿瘤的实验研究基础，因此，选择Kaempferol及Caffeic acid分别与9个Hub Gene小分子蛋白(其中RHOA未检索到其pdb格式文件，不予纳入)进行分子对接。对接蛋白核心结构的pdb文件格式(*. pdb)下载于RCSB PDB数据库: SRC[1CSK(PDB ID，下同)]、PIK3CA(6GVF)、PIK3R1(3HHM)、EGFR(3IKA)、ERBB2(2A91)、VEGFA(6T9D)、GRB2(1JYU)、PTK2(6I8Z)、10HSP90AA1(5NJX); 使用PyMOL对蛋白进行去水、去除有机物等处理。在ZINC平台下载活性化合物MOL2格式文件，PyMOL转换为pdb格式，运行AutoDock和AutodockTools，获取对接最低结合能，根据对接结果筛选出最具可能性的蛋白结合位点。

1.5 富集分析

基于前10个Hub Gene做富集分析。利用DAVID网站中的基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)相关数据库对其相关生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)和信号转导通路进行富集分析与整合，建立数据文件。

根据P<0.05确定KEGG中涉及的信号转导通路，并根据P值大小取前20条绘制气泡图，采用Cytoscape制作通路-靶点可视化网络图。确定BP、CC、MF涉及的相关条目，各选取前20条结果绘制条形图。

2 结 果

2.1 活性成分获取

根据数据库筛选出33个MT有效活性成分，候选活性成分中，由于Tenacissoside A、H、I有大量文献支持，故将此3种成分也纳入后续研究，得到总有效活性成分36个，见表2。

表2 MT有效活性成分

2.2 MT活性成分及GC潜在靶点获取

共得到MT活性成分潜在靶点499个, GC相关靶点871个，名称转换为基因名后利用Venn图取交集得到130个交集基因，见图1。

图1 交集基因Venn图

2.3 PPI网络构建及核心基因筛选

String数据库共筛选出116个关键基因，制作PPI网络图，并由Cytoscape可视化制作“药物-成分-靶点-疾病”网络图(见图2), Kaempferol、Tenasogenin、Drevogenin A等在MT抗GC作用中最突出。由MCC筛选的10个Hub Gene中(见图3),SRC、PIK3CA、PIK3R1与MT治疗GC作用机制的相关度较高。

A: String PPI网络图; B: “药物-成分-靶点-疾病”网络图。图2 PPI网络构建图

图3 Hub Gene筛选图

2.4 分子对接

分子对接的最低结合能见表3, 根据表3绝对值作雷达图将数据可视化，可以看出SRC、PTK2分别与Kaempferol及Caffeic acid对接最稳定，见图4。图5为蛋白位点结合模拟图，充分说明了MT对GC的稳定作用。

表3 最低结合自由能 kcal/mol

图4 分子对接数据可视化雷达图

A: SRC与Kaempferol在THR-42、ASP-27、THR-23、TRP-47、ASP-44位点结合; B: SRC与Caffeic acid在LYS-43、LYS-67、ARG-68位点结合; C: PTK2与Kaempferol在ARG-550、PRO-585、ASN-628、LEU-584位点结合; D: PTK2与Caffeic acid在CYS-502、ASP-564、ILE-428位点结合。图5 分子对接蛋白位点结合图

2.5 富集分析

KEGG富集分析预测信号转导通路57条，主要涉及ErbB、VEGF、EGFR、PI3K/Akt等，与以上信号通路最相关的基因为PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、GRB2(见图6)。

A: KEGG通路富集分析气泡图; B: 通路-靶点可视化网络图。图6 信号转导通路富集分析

GO富集预测BP相关条目62个, CC相关条目16个, MF相关条目24个，各选取前20条绘制条形图(见图7)。MT抗GC作用过程与酪氨酸激酶受体2(ERBB2)信号通路、血管内皮生长因子受体(VEGFR)信号通路、表皮生长因子受体(EGFR)信号通路、黏着斑等相关，其中可能涉及细胞质膜(plasma membrane)、顶端质膜(apical plasma membrane)、质膜细胞质侧的外源成分(extrinsic component of cytoplasmic side of plasma membrane)等CC, 并受Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase activity)、蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)等MF的影响。

A: GO-BP; B: GO-CC; C: GO-MF。图7 GO富集分析

3 讨 论

本研究利用网络药理学技术，整体评价MT与GC的网络关系，并预测了MT作用于GC的分子机制。本研究通过搜索文献及平台大数据筛选并确定MT活性成分36种，网络节点度值较大的Kaempferol、Tenacissoside H、Scopoletin、Caffeic acid等均可能在后续研发抗肿瘤新药的过程中成为先导化合物。大量药理研究结果发现, Kaempferol[37]具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用, Tenacissoside H[38-39]可通过影响PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导肿瘤细胞发生自噬, Scopoletin[40]具有抗氧化和抗炎特性，在诱导肿瘤细胞凋亡和自噬上发挥重要作用, Caffeic acid[41]可直接靶向Erk1/2以降低癌症发生率，这提示MT治疗GC的机制可能与促进肿瘤细胞的凋亡与自噬最为相关。

116个关键基因中通过MCC算法筛选出Hub Gene 10个，其中PTK2是非受体蛋白酪氨酸激酶，又叫黏着斑激酶(FAK), 可激活PI3K/Akt通路，促进肿瘤细胞侵袭与转移[42];SRC能影响Ras/Raf/MEK/ERK及SRC/FAK通路，促进肿瘤细胞生长分化及迁移[43-44]; 此外,PIK3CA也参与调节PI3K/AKT通路影响肿瘤生成[45]。

GO富集分析中，VEGFR相关信号通路在BP富集较高，影响MT抗GC的主要生物过程，临床已有针对VEGFR的治疗药物—单克隆抗体雷莫芦及酪氨酸激酶抑制药阿帕替尼，用于延长患者生存时间[46-47]; 帕尼单抗、西妥昔单抗及尼妥珠单抗则可作用于另一富集较高的EGFR抑制胃癌进展[48]。BP高富集的ERBB2可能对开发新靶向药物具有指导意义。MF富集较高的蛋白酪氨酸激酶活性相关抑制药物已被应用于临床[47], 蛋白磷酸酶结合过程及Ⅰ型磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶也可能成为新药研发的突破点。结合KEGG富集, MT可能通过影响PI3K/AKT、Ras/Raf/MEK/ERK、SRC/FAK等信号通路抑制GC的发生与发展。分子对接结果验证了MT活性成分Kaempferol及Caffeic acid能够与SRC、PTK2、HSP90AA1、PIK3CA、PIK3R1、EGFR、ERBB2、VEGFA、GRB2等受体蛋白自发结合，充分说明了预测结果的可信性。

目前，化疗仍是晚期GC的主要治疗手段，而肿瘤细胞耐药及胃癌特效药缺乏是近年来急需突破的难点，中药联合化疗可增效减毒，提高患者生活质量。MT制剂现已被广泛应用于肝癌、肺癌、胃癌、食管癌的联合化疗，对其活性成分进行研究不仅能为后续相关药理研究提供理论基础，还可能为GC相关通路中蛋白调节提供新的研究方向，对中晚期GC临床用药具有指导意义。

网络药理学作为兼具系统层次及生物网络的新兴学科，对临床用药指导及新药研发产生了巨大影响，但其分析过程中存在较多不确定性[49], 因此本研究尚需进行蛋白水平实验、细胞模型实验、动物模型实验及临床试验对MT治疗GC分子机制加以验证[50], 以完善本药物理论研究。