基于网络药理学探讨莪术—黄连药对治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

贾庆玲，王煜姣，丛军，凌江红，蔡淦

上海中医药大学附属曙光医院脾胃病科，上海200021

慢性萎缩性胃炎(CAG)是消化系统常见病和疑难病之一。“CAG→肠上皮化生→不典型增生→胃癌”被认为是胃癌的经典演化模式，CAG伴肠上皮化生和异型增生者的胃癌发病率高达6%，因此防治CAG对降低胃癌发病率具有重要意义。中医药以其多途径、多靶点治疗疾病且不良反应少的优势，在CAG防治中受到广泛关注。首届全国名中医蔡淦教授认为，CAG伴癌前病变与瘀、热、虚密切相关，瘀热互结是癌前病变发生的关键环节，因此CAG治疗应重视化瘀清热，并依此创制莪连颗粒。该方重用莪术—黄连为君，莪术行气破血、消积止痛，黄连泻火解毒、清热燥湿，两药合用以增化瘀清热之功。现代药理学研究表明，莪术具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、调血脂等多种药理学作用[1]，黄连具有抗菌消炎、抗消化性溃疡、抗肿瘤、降血脂、降血糖等药理作用[2]。2021年1月—2月，我们基于中药多成分、多靶点的特点，采用网络药理学方法，从整体上对莪术—黄连药对以及疾病的靶点进行预测，分析药物分子、靶点基因、通路以及疾病之间的关系，进一步揭示莪术—黄连药对治疗CAG的作用机制。

1 材料与方法

1.1 莪术—黄连药对活性成分的筛选和靶点基因的获取 通过TCMSP数据库(https://tcmspw.com/index.php)分别检索“莪术”“黄连”，以口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似度(DL)≥0.18作为筛选条件，筛选出莪术、黄连的活性成分及相应靶点基因，输入UniPort数据库(https://www.uniprot.org/)检索相应靶蛋白，得到标准化基因名。

1.2 CAG相关靶点基因的获取 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)检索关键词“Chronic Atrophic Gastritis”，获取CAG相关靶点基因，在UniPort数据库中转化为相应的标准化基因名。

1.3 莪术—黄连药对的有效成分靶点基因和CAG共同靶点基因的筛选 将莪术—黄连药对有效成分靶点基因和CAG相关靶点基因同时录入VENNY2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)软件，映射后构建维恩图以获取交集基因。

1.4 药对—有效成分—靶点基因—信号通路—疾病相互作用的网络构建与分析 String数据库(https://string-db.org/)选择“Multiple Proteins”，将共同交集基因输入，蛋白种属选择“Homo sapiens”，最低相互作用阈值选择“medium confidence(0.400)”，其他参数均保持默认设置，构建蛋白—蛋白相互作用(PPI)网络。DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路分析(物种选“Homo sapiens”，以P<0.05作为显著功能和通路的临界值)。通过Cytoscape3.7.2软件，构建莪术黄连药对—活性成分—靶点基因网络、药对—有效成分—靶点基因—信号通路—疾病网络，使用network analyzer功能进行网络特征分析，根据度值预测治疗节点，节点的大小与度值相关，节点越大说明该节点在网络中越重要。

2 结果

2.1 莪术—黄连药对的活性成分及靶点基因 通过TCMSP数据库，根据OB≥30%和DL≥0.18筛选得到18个活性成分，其中12个化学成分药动学特征良好，见表1。去除重复靶点基因和非人类靶点基因，得到180个靶点基因，获得其相应标准基因名以构建药对—活性成分—靶点基因网络，见OSID码图1。活性成分度值排名前三的成分为槲皮素、(R)-Canadine、常春藤皂苷元，度值分别为143、28、22；靶点基因度值最高的基因为PTGS1、PTGS2、NCOA2、SCN5A、RXRA、KCNH2、AR，度值分别为9、9、8、8、8、8、8。

表1 莪术—黄连药对活性成分表

2.2 莪术—黄连药对活性成分靶点基因和CAG共同靶点基因筛选结果 通过GeneCards数据库检索获得CAG靶点基因639个，利用UniPort数据库将相关基因标准化。将莪术—黄连药对活性成分靶点基因与CAG相关基因输入VENNY2.1，得到交集基因78个，见表2。挑选78个交集基因中度值前25位的基因构建PPI网络，共有25个节点、241个边，见OSID码图2。Cytoscape分析显示，度值排名前3位的基因为AKT1、IL-6、PTGS2，度值均为23。

表2 莪术—黄连活性成分靶点基因与CAG靶点基因交集表(前25位)

2.3 药对与疾病共同靶点基因的GO富集分析和KEGG通路分析结果 对78个靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。设定阈值P<0.05，选取靠前的富集结果。见表3、表4。

2.4 莪术黄连药对—有效成分—靶点基因—信号通路—疾病相互作用的网络分析结果 基于以上结果，莪术—黄连药对可能通过12个活性成分、78个靶点基因发挥对CAG的治疗作用，以此构建莪术黄连药对—有效成分—靶点基因—信号通路—疾病的相互作用网络，见OSID码图3。

3 讨论

CAG归属于中医学“胃脘痛”“胃痞”范畴。莪连颗粒是首届全国名中医蔡淦教授的临证验方，由莪术、黄连、蒲公英等12味中药组成，具有活血化瘀、清热解毒、健脾理气之功效，主治CAG伴肠上皮化生、异型增生。该方在临床应用已30多年，具有逆转CAG癌前病变的作用[3-4]。该方重用莪术—黄连为君，其中莪术味苦性辛温，归肝、脾经，功专行气破血、消积止痛。《医家心法》：“凡行气破血、消积散结皆用之”。黄连味苦性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，乃泻火解毒，清热燥湿，厚肠止泻之佳品。《药类法象》：“泻心火，除脾胃中湿热，治烦躁恶心，郁热在中焦，兀兀欲吐”。两药配伍应用，活血化瘀、清热燥湿之功显著。现代药理学研究表明，莪术有改善微循环、抗炎、抗氧化、抗肿瘤功效；黄连有保护胃黏膜、抗炎、抑杀幽门螺杆菌(Hp)、抗肿瘤等作用[1，5]。

表3 莪术—黄连药对治疗CAG的GO富集分析结果

表4 莪术—黄连药对治疗CAG的KEGG通路分析结果

本研究通过OB和DL评估，筛选出莪术—黄连药对的12个有效活性成分，180个靶点基因，其中槲皮素、(R)-Canadine、常春藤皂苷元是药对的主要活性成分，所对应的成分靶点相对较多，表明它们可能是莪术—黄连药对治疗作用的主要成分。靶点蛋白基因度值最高的基因为PTGS1(9)、PTGS2(9)、NCOA2(8)、SCN5A(8)、RXRA(8)、KCNH2(8)、AR(8)，表明莪术—黄连药对可能作用于这些关键靶点基因。该网络体现了一个活性成分可对应多个靶点蛋白，一个靶点蛋白可对应多个活性成分，表明莪术—黄连药对的治疗作用是一个复杂的过程。

基于David数据库对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，结果表明，GO-BP分类主要涉及凋亡过程的负调控等。已有研究表明，CAG发展为癌变的发病机制与细胞增殖与凋亡相关。其中，促凋亡基因Bax、Fas的表达逐渐增高，而细胞增殖的负调控基因p16的表达逐渐降低[6-9]。GO-MF分类主要涉及酶结合等。研究表明，随着CAG进展，胃蛋白酶和内在因子的产生逐渐减少[10]。KEGG通路分析显示，莪术—黄连药对治疗CAG主要涉及TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等。其中，TNF信号通路作为主要通路，涉及TNF、MMP-9、AKT1、IL-6、IL-1β、MAPK1等靶点基因。动物实验表明，CAG大鼠血清IL-6、TGF-β1和MAPK含量均存在不同程度的增加[11-12]。TNF-α、MMP-9、IL-1β、p-AKT1则在CAG患者胃黏膜组织或CAG大鼠血清中高水平表达[13-16]。上述结果表明，TNF信号通路在CAG发生、发展中发挥着重要作用。此外，CAG患者及模型大鼠胃黏膜组织中TLR4和NF-κB表达增高[17-18]。

PPI网络分析发现，AKT1、IL-6等均为共同靶点，表明莪术—黄连药对治疗CAG可能主要涉及AKT1、IL-6等靶点基因。因此推测，莪术—黄连药对可能通过调节AKT1、IL-6等靶点基因，TNF信号通路、MAPK信号通路从而发挥抗CAG作用。

本研究初步探讨了莪术—黄连抗CAG的网络药理学机制，且所得结果与现有研究报道基本相符，为系统地开展莪术—黄连抗CAG的实验研究和临床应用提供了理论依据。但是，莪术—黄连药对发挥抗CAG作用的深入研究仍待后续验证。