外源无机砷形态对蜈蚣草中砷和植物营养元素微区分布的影响研究

龚雪刚，吴亮亮，杨越晴

(矿冶科技集团有限公司 环境工程研究设计所，北京 100160)

砷(As)作为环境中一种普遍存在的有毒类金属元素，具有高毒、致癌、致畸作用，是我国68种优先控制污染物之一[1]。然而，随着工农业的快速发展和矿业活动的加剧，我国土壤As污染问题愈发严重。据《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国实际调查的630万km2土壤中，As超标点位占2.7%，累计污染面积达17万km2。此外，我国西南和华南地区均出现了大面积区域的土壤As污染问题，并对居民健康安全造成了严重威胁[2-4]。

蜈蚣草(PterisvittataL.)作为最早被发现和报道的砷超富集植物，具有极强的砷吸收和转运富集能力以及细胞耐砷抗砷性，是一种极为有效的砷污染土壤修复植物[5-7]。为有效了解蜈蚣草的富砷机理，国内外学者从植物生理、生物化学、分子机制等多方面开展了大量研究，重点提出了砷酸还原、液泡区隔化和抗氧化胁迫等砷解毒和砷超富集作用机制[8-10]，这为人们深入认识和了解蜈蚣草吸收和富集砷的行为过程提供了重要的理论基础。然而，也有研究指出相关营养元素会对蜈蚣草吸收和累积As的能力产生影响[7，11-12]，但对于营养元素与As在蜈蚣草中的交互作用，特别是元素微区分布与As富集间的作用关系研究鲜有涉及[13-14]。

元素微区分布研究一方面可以直观反映目标元素在植物体向顶运输过程中的运移途径和赋存特征[15-16]，同时还有助于探究植物体内元素间的交互作用，对深入揭示植物重金属耐受、解毒等机制具有重要意义[17-18]。因此，本文拟通过同步辐射微区X射线荧光(μ-SRXRF)分析手段，研究不同形态As处理蜈蚣草中营养元素和As向顶运输过程中在不同组织部位的分布和赋存规律，揭示外源无机As对蜈蚣草体内营养元素和As微区分布的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计

将采自湖南郴州市的蜈蚣草孢子均匀撒在播种盘基质中(花卉土∶蛭石=1∶1)，洒水保持湿润，覆薄膜保湿，置于温室内培育，室内昼间温度25 ℃，夜间温度20 ℃，湿度65%。当孢子发育出数片幼叶时，分苗移栽到1/5强度的霍格兰营养液(pH=6.0)中进行培养。3～6个月后，选取长势优良且相似的蜈蚣草苗备用。

试验共设计三组处理：空白对照(A)、三价砷(B)、五价砷(C)。每组处理设置三个重复。三价砷和五价砷分别由亚砷酸钠和砷酸钠配制，配置浓度为10 mg/L。为保证不同砷形态处理的有效性，每三天换一次营养液[19]，4个周期共12 d后将蜈蚣草收获。将收获的蜈蚣草用去离子水洗净，鲜样保存备用。

1.2 μ-SRXRF原位分析

蜈蚣草鲜样组织横截面的同步辐射微区X射线荧光面扫描分析(μ-SRXRF)在上海同步辐射装置硬X 射线微聚焦及应用光束线站BL15U1 进行，扫描模式设置为荧光模式。试验采用入射光能量12 keV，扫描步长30～50 μm，每点的扫描测量时间为2 s。分析元素的XRF信号采用硅漂移探测器(Vortex-90EX，SII，USA)收集，主要包括As、Ca、Cu、Fe、Mn、P、S、Zn和Compton散射。同时为校正同步辐射束流变化对荧光信号强度的影响，采集的元素荧光强度均需对入射光强度和Compton散射作归一处理。校正后的荧光强度即表示相应元素的相对含量。

1.3 数据处理

同步辐射微区扫描数据利用Igor Pro 5.01软件进行处理并用Origin 8.0 软件绘制元素荧光Mapping图，相应的Mapping荧光数据采用SPSS 21.0(SPSS Inc，Chicago)软件进行相关统计分析。

2 结果与讨论

2.1 蜈蚣草组织中As的微区分布特征

图1为采用同步辐射微区扫描蜈蚣草不同组织横截面砷的原位荧光信号分布，白色表示As信号强而含量高，黑色代表As元素荧光信号弱而分布少。由图1可以看出，不同形态的无机砷处理对蜈蚣草各组织部位中砷元素的微区分布基本无影响，但各组织部位间砷的微区分布存在组织特异性。在根部，As主要集中分布于与根表皮紧邻的皮层组织和维管组织(如维管柱和维管柱鞘)，且表现出类似带状分布特征(图1B-根和C-根)；与根部类似，蜈蚣草茎部的As同样集中于维管柱和皮层组织，并以近轴面皮层细胞中的砷含量最高，茎表皮和远轴面等组织中As含量低(图1B-茎和C-茎)。这一现象与As在蜈蚣草体内主要通过维管束组织和木质部进行向顶运输的转运机制相一致[20-21]。在羽叶部位，砷信号主要分布于羽叶叶缘部位，特别是生长有孢子囊的叶缘部位具有很强的As信号(图1B-叶)，近叶脉端叶肉组织则As信号较弱，表明叶肉组织是砷在羽叶中的主要富集部位，与陈同斌等测定的羽叶砷浓度分布规律保持一致[22]。另一方面，由于蜈蚣草羽叶液泡对砷具有明显的区隔化作用[8，23]，且羽叶不同亚细胞结构砷浓度分布存在巨大差异化(液泡≫细胞壁>细胞器)[22]，进而导致羽叶横截面砷信号分布呈现巨大化差异。

图1 蜈蚣草各组织中As分布的μ-SRXRF图Fig.1 μ-SRXRF images of As distribution in different parts of P.vittata L.

2.2 植物必需营养元素在蜈蚣草中的分布

图2为不同砷处理条件下蜈蚣草各组织部位横切面7种营养元素分布图，其中白色表示部位荧光信号强，元素分布含量高；黑色代表元素荧光值弱，分布少。在两种无机砷处理下，蜈蚣草各组织部位营养元素的分布差异较大。添加三价砷时，大量营养元素Ca、P和S在蜈蚣草各组织部位横切面整体分布相对均匀，仅茎部维管组织部位存在较为明显的高含量分布点。而五价砷处理时，大量营养元素Ca、P和S在蜈蚣草各组织横切面均存在明显的分布高点，如羽叶叶脉、茎皮层组织、根部皮层组织及维管组织等部位都可观察到高浓度的Ca、P和S富集(图2)。已有研究发现，水培条件下，蜈蚣草对亚砷酸盐的吸收速率远低于砷酸盐[24]，且As(Ⅲ)相较于As(Ⅴ)又更易于排出细胞外[25]。另外，蜈蚣草在砷胁迫下可以通过调节磷、钙的亚细胞分布来提高其耐砷毒的能力[26]。因此，可以推断砷胁迫下，蜈蚣草组织中Ca、P和S的高含量分布有助于提高蜈蚣草的耐砷毒能力，保护植株正常生命活动。

图2 砷处理条件下蜈蚣草组织中营养元素分布图Fig.2 Nutrition elements distribution characteristics in tissues of P.vittata L.under arsenic treatments

与大量营养元素Ca、P和S不同，Cu和Zn作为植物生长的微量必须营养元素，是植物中多种氧化还原酶的组成部分或活化剂[27]。由图2可知，两种形态砷处理蜈蚣草各组织中均有明显的Cu和Zn分布，但其具体分布特征受砷形态影响较大。当外源砷为三价砷时，Cu和Zn在蜈蚣草羽叶中部区域和根部维管组织部位存在非常明显的高浓度分布区，茎部则主要在紧邻表皮的区域存在一个高点。而添加五价砷时，Cu和Zn在羽叶中部和叶脉部位都存在高浓度的富集，在茎部则集中分布于近轴面组织部位而远轴面端分布较少，根部则从中间的维管柱到根皮层组织均有高含量分布点并呈现出带状分布规律。此外，Zn在叶缘端的孢子囊部位有非常明显的分布高点，而Cu没有这一现象，这可能与Zn和As在蜈蚣草体内的运输过程存在一定程度的相似性有关[14]。

Fe、Mn作为植物体内移动能力较弱的元素，不同形态砷处理下，蜈蚣草各组织部位中的Fe和Mn分布无明显差异(图2)。对于羽叶而言，Fe、Mn多集中于叶中脉而叶缘叶肉组织含量较低；在茎横切面上，Fe和Mn信号均较弱，且无明显的分布高点；根部则重点分布于表皮皮层组织和维管组织中，且以表皮皮层信号更为强烈。

2.3 As与营养元素分布的相关性分析

通过元素荧光信号强度的相关性分析，有助于探究蜈蚣草各组织部位As与营养元素分布之间的相关关系及交互作用。由表1可知，两种无机砷处理下，As和其他7种营养元素在蜈蚣草各组织部位中的微区分布均存在显著正相关性。陈同斌等[28]对砷超富集植物大叶井口边草各组织中砷和营养元素的微区分布研究发现，大叶井口边草羽叶和茎(叶柄)中As和营养元素间的微区分布同样存在显著或极显著的正相关，与本研究结果保持一致。这些结果表明，As和营养元素在砷超富集植物中的转运过程可能存在协同作用。

表1 不同砷处理条件下蜈蚣草各组织中As与其他营养元素的相关系数

3 结论

不同形态无机砷处理对蜈蚣草各组织部位中砷元素的微区分布无影响，其中蜈蚣草根茎组织中砷的微区分布主要集中于皮层组织和维管组织，羽叶中砷的微区分布则主要位于叶缘叶肉组织。植物营养元素在蜈蚣草各组织部位中的微区分布受砷形态影响较大，但各组织中As的微区分布与P、S、Ca、Cu、Zn、Fe和Mn等元素分布规律相似，均存在显著正相关性。