临床检验标准物质现状及研制方法

丁敏 / 上海市计量测试技术研究院

0 引言

2021年国际法制计量组织和国际计量局发布的“世界计量日”主题为“测量守护健康”。临床检验是健康监测的重要手段，临床检验数据的准确、有效是疾病正确诊断的关键，因此，实现检验结果准确性和可比性就需要建立和保证其量值溯源性。多年来，临床检验量值的溯源问题在国际上受到广泛重视。欧洲议会和理事会在1998年10月签署关于体外诊断器具的指令（Directive 98/79/EC），该指令的一项关键内容是要求体外诊断器具的校准物质和（或）质控物质定值的溯源性必须通过已有的高一级的参考方法和（或）参考物质予以保证[1]。为配合该指令的实施，国际标准化组织（ISO）1999年起草了5个相关标准[2]， 其中与标准物质密切相关的ISO 17511中的“体外诊断医疗器械——校准品、正确度控制品、人源样品定值的量值溯源性的建立要求”[3]，明确提出临床检验的量值溯源是运用参考测量程序或参考物质建立或验证常规检验结果的准确性。由此可见，参考物质即标准物质是临床检验量值溯源的重要的标的，是检验结果准确性的重要保障。

1 国外临床检验标准物质发展状况

发达国家从20世纪中期开始重视标准物质在临床量值传递中的作用，各国计量机构将生物、临床等新兴领域标准物质研究作为标准物质发展的重点领域。20世纪60年代美国标准和技术研究院（NIST）利用研制的胆固醇系列标准物质使全美临床实验室测量血液中胆固醇结果错误的阴性和阳性数从1969年的18%稳定地减少到近年的3.0%[4]； NIST从2009年以来投入大量经费开展蛋白质组和基因组测量标准研究，建立了一批有机生化及生物大分子等高准确度计量方法以及体外诊断的标准物质，为诊断试剂盒等的量值溯源提供技术服务。2015年，美国总统奥巴马宣布美国“精准医学计划”，进一步推动作为临床检验“砝码”和“标尺”的标准物质的研制和发展。

位于比利时的标准物质和计量研究所（IRMM）于1970年后期开始临床检验用标准物质的研制，其他国际组织如国际原子能机构（IAEA）等也较早开展了这方面的研究工作[5]。世界卫生组织（WHO）于1997年发布首个用于核酸扩增技术的核酸标准物质。英国的国家生物标准和控制研究所（NIBSC）与WHO合作，研制了大量涉及蛋白、抗体、激素等国际通用标准物质。2017年WHO公布的生物标准物质目录中共有430种生物标准物质，其中大部分为临床检验相关标准物质。

目前，临床检验项目至少有数百种，由于参考系统的不完善，国际约定参考测量程序的空缺，根据国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM）列表显示，截至2019年，列入JCTLM列表的国际参考物质有295种，参考测量程序有201个，18家参考测量实验室可以提供187项参考测量服务，涉及150种分析项目，其中临床化学检测项目137种，涉及类别有维生素和微量营养物质、蛋白质、非肽类激素、非电解质金属、代谢物和底物、酶、电解质、药物浓度等[6]。

2 我国临床检验标准物质发展现状

我国临床检验标准物质发展起步较晚，但是发展迅速，目前，与大众健康相关的生物和临床有证标准物质已有近千种。2006年，国家科技部“863”计划将体外诊断试剂及参考物质列入专项，项目的目标之一是研制16个临床生化标准物质,包括7个酶学标准物质、7个无机离子标准物质和2个小分子代谢物标准物质[7]。近年研制成功的冷冻人血清中无机成分分析标准物质，血清胆固醇、总甘油、游离甘油和甘油三酯标准物质，都为相应领域的临床检验量值溯源提供了有效的保证。

核酸标准物质方面：2005年国家卫生部临床检验中心研制的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸血清标准品为首个核酸有证标准物质，至今为止核酸/质粒有证标准物质发展迅速，主要为乙肝、丙肝病毒、人类免疫缺陷、人乳头瘤病毒核酸标准物质。新型冠状病毒肺炎疫情爆发以来，中国计量科学研究院、上海市计量测试技术研究院迅速响应，研制了新型冠状病毒核酸标准物质，为核酸检测质量控制提供有力保障[8]。蛋白质标准物质方面，目前，绝大部分蛋白质相关实验测定结果没有溯源性，我国蛋白质标准物质主要有人类免疫球蛋白、血清白蛋白、抗凝蛋白C等不同基体形式、不同浓度水平的标准物质。细菌类标准物质方面，微生物菌体标准物质研究方向已由标准菌株向含基体的微生物标准物质方向发展。

目前，我国生物类标准物质尚存在以下问题：一是复杂基体类标准物质种类少，覆盖面不够宽，现今国内研究的生物标准物质多为纯物质、溶液标准物质，且已有的基体类标准物质特征量以无机元素居多，有良好的互换性的血清、全血基体，且表征生物特性量的标准物质较少；二是生物大分子类标准物质种类较少，国内核酸和质粒类标准物质近几年发展增速较快，但是蛋白、脂类、生物素、多肽、核酸及细胞等标准物质仍较为缺乏，肿瘤和重大传染病标志物的标准物质亟待开发；三是临床标准物质溯源性有待解决，能溯源到SI单位的主要为一些化学定义明确的化合物，包括电解质类（钾、钠、氯等）、代谢物（如胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素等）和甲状腺激素等，生物大分子类物质由于没有建立参考测量程序和形态表征等问题带来研制的困难。

3 临床检验标准物质的研制

临床检验标准物质是生物测量量值溯源和比对的基础，按其研制过程包含原材料收集制备、均匀性检验、稳定性检验、定值、不确定度评价、互换性研究等主要步骤。

3.1 标准物质的原材料选择及制备

1）原材料的选择

临床检验标准物质材料的选择应遵循适用性、代表性以及易复制的原则[9]。标准物质材料应有稳定的来源，保证标准物质的有效复制，以维持量值的连续溯源性。另外，生物基体中成分标准物质的基体选择应考虑其与实测样品的同质性，同一临床检验指标，基体不同测量结果会有较大差异。例如全自动生化分析仪测定血清血糖的结果与快速血糖分析仪测定末梢血、静脉全血血糖结果存在明显差异[10]，临床检验标准物质基体材料还应重视其安全性，要保证材料不携带危险的传染源、无生物安全性危害。例如牛血由于不含有肝炎、艾滋病等致病因子，且牛血的基体与人血极为相似，牛血也是较常用的人血替代品[11-14]。

2）标准物质的制备

应根据临床样本的性质选择合理的制备程序、工艺，防止外来污染，过程损失造成特性量值的影响，同时使样本具备长时间保存的量值稳定性。下面列举了样本制备的几种情况：一是试剂的纯化。临床检验的纯度标准物质主成分通常需要达到99.5%以上的含量，需采用重结晶、区域熔融等方法对市售材料进行提纯[15]，蛋白类材料可通过离子交换色谱法、排阻色谱法和色谱层析等方法纯化[16]；核酸类材料可以通过层析法、磁珠法或通过商用的试剂盒进行纯化[17,18]。二是特性组分的添加。为实现标称值与临床检测范围相当，可以通过定量加入外源性成分和测定添加内源性成分的方法制备标准物质[19]，添加特性组分时，要充分考虑引入的杂质或组分对样本基体的影响。三是样本的均匀化。采用合适的工艺以及正确运用颗粒粉碎和混合技术，保证样本颗粒的均匀以及多种基体、材料混合的充分，均匀化的过程中要及时进行均匀性初检以对制备效果进行评价。四是样本的包装保存处理。当标准物质的特性成分不稳定时需要添加一定的稳定剂，如乳糖、蔗糖、甘露醇等。对于血、尿液等难以稳定保存的基体，通常通过冷冻干燥、冷冻的方法来保存，也可加入叠氮化钠或者通过γ辐照等来防腐。各种保存方法也需要开展可行性评估，避免对标准物质主成分的影响。例如，有报告指出，人血清酯蛋白在冻干过程中发生变性，且不可逆，因此，NIST在制备人血清酯蛋白SRM-1951-1a时，放弃了原来采用的冻干步骤，而采取超低温-80 ℃保存[20]。

3.2 标准物质的均匀性和稳定性检验

均匀性检验是为确认标准物质特性值在材料各部分（或单元）间没有差异的过程。稳定性是在一段时间内标准物质保持其量值的性质。我国标准物质管理办法中明确规定，一级标准物质稳定性应在一年以上，二级标准物质稳定性应在半年以上。均匀性、稳定性检验的抽样方法、检验要求和检验方法在JJF 1006-1994《一级标准物质技术规范》[9]、JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[21]、ISO导则35《标准物质-均匀性和稳定性的表征和评价指南》[22]中有明确规定。选定均匀性检验方法时还需充分考虑实际最小取样量是否满足使用需要，避免评价结果缺乏充分代表性。对于临床检验标准物质，由于储存条件要求较高，运输条件往往难以达到要求，因此，在设计特定的基体和特性组合时，应在可能的运输温度条件下进行短期稳定性研究。

3.3 标准物质的定值

临床检验标准物质定值过程要保证其溯源性，依据ISO 17511：2020，临床标准物质应根据其等级采用不同计量学等级的测量程序或方法进行定值，该标准中的溯源到SI单位的完整校准等级图（见图1），给出一级参考物质（通常为纯物质）采用质量平衡法、定量磁共振、基因测序等测量程序进行定值，一级参考物质通过重量法、计数法等一级测量程序（通常为绝对法）将量值传递到一级校准品[23]，再通过参考程序传递到具有临床互换性的二级参考物质或校准品。JJF 1855-2000中给出了质量平衡法等纯度标准物质定值的主要方法和相关要求[24]。对于部分定义明确的临床小分子化合物，定值时通常使用的方法有等离子体质谱法、同位素稀释质谱法、原子吸收法、离子色谱法、液相色谱法[25]。其中，同位素稀释质谱法是临床上广泛使用的参考测量程序，还应用于临床有机酸、葡萄糖等代谢物以及蛋白等生物大分子的定量测定。截至2018年，国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM）给出的26个完整的临床参考溯源系统中，有19个项目是基于同位素稀释质谱法作为参考测量程序的[26]。近年临床核酸标准物质定值技术发展迅速，已有多种病毒核酸类标准物质采用数字聚合酶链式反应法（dPCR）进行准确定量[27,28]。

图1 ISO 17511：2020 溯源到SI单位的完整校准等级

3.4 标准物质的互换性

ISO 17511：2020对物质互换性定义为“由两个测量程序测量参考物质中的特定量得到的测量结果间的关系，与测量特定样品的特定量得到的测量结果关系的一致程度”[3]。出于调整浓度、贮存和运输等目的，对标准物质原料所进行的成分调整（如添加外源性物质）或加工（如冻干）等[29]，造成基体与新鲜临床样品的差异。标准物质基体如果与天然人体样品不同或者是经过处理的天然人体样品，均需要验证其互换性。美国临床实验室标准研究所（CLSI）出版的EP-14 A3《处理样本的互换性评价》给出了临床标准物质的可互换性评价方法[30]。

以牛血清中钾钠氯标准物质的可互换性试验说明[19]：选取20份病人新鲜血清作为分析样本，5份牛血清标准物质作为对比样本，以原子吸收分光光度法和临床检验离子选择性电极法在同一天内对上述所有样本进行检测，检测顺序为将标准物质随机插入病人新鲜血清。病人新鲜血清样本用原子吸收分光光度法检测结果的平均值和用离子选择性电极法检测结果的平均值，采用戴明（demiding’s）线性回归法拟合回归方程，将牛血清标准物质原子吸收分光光度法检测值代入回归式得到对应离子选择性电极法回归预期值，通过统计计算给出的置信概率为95%的可信区间，若离子选择性电极法检测牛血清标准物质得到的结果是处于该区间内，认为处理后的标准物质基体与新鲜血清的基体差异可接受。

4 结语

临床检验标准物质的研制是发展和完善临床检验参考系统的必然要求，开展临床检验标准物质的研制需要加强计量部门、临床检验管理部门、临床实验室、诊断试剂和仪器生产厂商等领域的合作。以需求为导向，加快研制多发性疾病、危害性较大疾病诊断的相关标准物质；同时密切关注国内外行业发展趋势，瞄准体外诊断高新领域，研制高准确度标准物质，助力我国分子诊断POCT、基因芯片、液体活检和质谱检测等前沿新技术的临床应用。