基于转录组测序及韦恩分析探寻补气中药制剂发挥补气作用的靶基因及其生物学功能

黄丽萍,乔博灵,颜雪珍,赵 亭,纪昌春,杨 峥,张晓霞,郭正萍,罗苓芝

(1.陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2.西北大学生命科学院，陕西 西安 710069)

气虚是中医上的常见证候，多见于先天不足或者后天过度劳损所致，以少气懒言、疲劳、面色苍白、消化功能下降或营养不良、消瘦等为证候特点[1]，因常常涉及五脏，导致五脏运化失常，使脏腑功能发生盛衰偏向，继而可以引发机体一系列人体的轻、重疾病，因此气虚症状广泛存在于许多的中医疾病当中，需要选用合适的补气方药进行纠正。比如源于经典古方生脉散的中药保护品种益气复脉注射液，由红参、麦冬、五味子制备而成[2]，为临床上常用的一种中药制剂，具有益气养阴，复脉生津的功效[3]；由黄芪和党参经特殊工艺加工而成的制剂参芪扶正注射液[4-5]，具有益气健脾、培本固元的功效[6]，均被广泛地应用于临床各种疾病的治疗中，并且显示了良好的改善气虚症状的效果。

虽然临床中医生可以通过望、闻、问、切四诊等来获知对气虚疾病的判断，然而，临床上实际所取得的气虚症状与体征，其性质及状态均是模糊而不易量化的，并且随着人群的复杂化，社会转型期间众多因素的影响等等，往往被低估或过度评价，进而影响中药方药的使用和临床效果。近年来随着科学技术的迅速发展，高通量测序技术已经广泛应用于疾病及药物治疗后基因表达转录水平的研究，成为发现疾病基因靶点及其功能的重要手段之一[7]。

本研究利用高通量测序技术，对临床常用的具有补气作用的益气复脉注射液和参芪扶正注射液进行研究，分别考察气虚患者经过这两种中药制剂治疗后的差异表达基因及其生物学功能，并进行二者之间的韦恩分析，以探寻这两种制剂发挥补气作用的靶基因及其生物学功能，为后期研究气虚疾病的分子机制及其精准评价提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器：NannoDrop 2000c分光光度计2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)，基因扩增仪(GE4852T，杭州柏恒科技有限公司)，实时荧光定量PCR仪(CFX Connect Real-time system，美国Bio-Rad公司)，离心机(5424，德国Eppendorf股份公司)。

1.1.2 药品与试剂：临床治疗用中药制剂为益气复脉冻干粉针剂(天津天士力之骄药业有限公司生产，批号：20151205)和参芪扶正注射液(丽珠医药集团股份有限公司生产，批号：151219)。

另有淋巴细胞分离剂(Ficoll-Paque,Sigma,中国)，Total RNA Extractor(上海生工生物工程有限公司)，M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，2×SGExcel UltraSYBR Mixture(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 气虚患者的选择：由临床中医医师，依据《中药新药临床研究指导原则》[8]，选取2020年8月至2021年6月在陕西省中医医院收治的以气虚为主要病证特点的患者20例作为研究对象，以随机数字表法分为益气复脉治疗组(YQFM)和参芪扶正注射液治疗组(SQFZ)，治疗后气虚症状有明显改善者被纳入本项研究。陕西省中医医院医学伦理委员会审核并通过此研究方案。

1.2.2 分组与给药：患者入院后分别实施一个治疗周期(每天1次，共10 d)，治疗前后，分别进行气虚的评分和外周血的采集。气虚评分根据《中药新药临床研究指导原则》，患者外周血采用EDTA抗凝管收集。

1.2.3 抗凝外周血采集和Trizol法提取总RNA：对采集的抗凝外周血样品，以淋巴细胞分离液,应用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，按照TRIzol试剂法提取总RNA；提取完成后的RNA，采用NanoDrop超微量分光光度计检测RNA浓度。

1.2.4 RNA-Seq样品及其测序：RNA-Seq测序用样品，为2例患者的2对(4个)外周血样品。这2例患者分别经益气复脉和参芪扶正进行治疗，并显示出相似的气虚级别及改善程度的。2对样品为患者治疗前后的外周血样品，由上海烈冰生物医药科技有限公司进行测序分析，文库质量控制和定量使用Agilent2200进行，DESeq算法进行差异基因筛选。

1.2.5 实时荧光定量PCR：以提取的RNA为模板，用M-MuLV反转录试剂盒配制PCR反应体系，包含4 μg RNA和1 μl M-MuLV RT，在PCR仪上进行cDNA的合成及扩增，反应条件为：25 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min。合成后的cDNA，在Bio-Rad实时定量PCR仪上，进行SYBR GREEN荧光定量PCR反应和检测，25 μl反应体系，包含80 ng RNA及相应的引物，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min进行40个循环。

1.4 信息分析

1.4.1 差异表达基因分析：采用DESeq分析差异表达基因，差异基因筛选主要参考差异倍数(Fold change值)及P值作为相关指标，通常选取|Fold change|≥1.5，FDR≤0.05的差异基因作为显著差异基因。

1.4.2 GO(Gene Ontotology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析：基因筛选出的差异表达基因，应用超几何检验对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，以校正后的P≤0.05为阈值，满足此条件的GO词条和KEGG通路被认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 YQFM、SQFZ治疗前后的差异表达基因及其韦恩分析结果 RNA-Seq实验共获得51137个转录组mRNA，与治疗前相比，治疗后显示有差异的基因，YQFM有873个(图1A)，SQFZ有935个(图1B)，差异基因分析显示，差异明显的基因(|Fold change|≥1.5 FDR≤0.05)，YQFM有60个，其中34个基因上调，26个基因下调；SQFZ有85个，其中40个基因上调，45个基因下调。

为了取得气虚相关基因，即两个方药治疗后的共同的差异基因，我们对两组差异明显的基因进行了交集，韦恩分析(图1C)结果显示，经这两个方药治疗后，共有的、差异明显的基因有6个，分别是DUSP1、DUSP2、FKBP5、F8A2、C9orf129及EGR1。

A:YQFM治疗前后差异基因火山图；B:SQFZ治疗前后差异基因火山图； C：YQFM和SQFZ差异基因的韦恩分析图

2.2 YQFM、SQFZ治疗前后的差异表达基因的GO富集分析及其韦恩分析 分别对两组差异明显的基因进行GO富集分析，以P≤0.05为阈值，YQFM中满足此条件的基因，功能富集到生物过程的GO条目有277条，细胞组分有15条、分子功能有48条；SQFZ满足此条件的基因中，功能富集到生物过程的GO条目有236条，细胞组分有22条、分子功能有67条。

进行交集分析后，两组共有的生物过程的GO条目有32条(图2A)，包括昼夜节律(Circadian rhythm)、一氧化氮合成(Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等；细胞组分有2条(图2B),包括质膜组成成分(Integral component of plasma membrane)和质膜外侧成分(External side of plasma membrane)；分子功能有6条(图2C)，包括热休克蛋白结合(Heart shork protein binding),蛋白激酶磷酸化(MAP kinase tyrosine/serine/thereonine phosphatase activity)等。

图2 YQFM和SQFZ治疗前后差异基因的GO富集分析及其韦恩分析(P≤0.05)

2.3 YQFM、SQFZ治疗前后的差异表达基因的KEGG富集分析及其韦恩分析 对差异基因进行KEGG富集分析，YQFM中共富集到96条生物通路，SQFZ中共富集到195条生物通路，它们共有的生物通路有10条，大体可以分为3类，第一类与环境信息相关，主要为信号传导，包括MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信号通路和TGF-β信号通路；第二类与内分泌和免疫系统相关，包括脂肪细胞因子通路(Adipocytokine signaling pathway)和雌激素信号通路和NOD样受体(NOD-like receptor signaling pathway)；第三类是对外来物的应答反应，包括疟疾(Malaria)、非洲锥虫病(African trypanosomiasis)、军团杆菌病(Legionellosis)、弓形体病(Toxoplasmosis) 和沙门菌(Salmonella)(图3)。

图3 YQFM和SQFZ差异基因KEGG富集的

2.4 实时定量PCR检测队列样本中共有差异基因的表达变化 我们对20例有气虚症状的患者，进行了YQFM和SQFZ的治疗，经临床医师评估有明显改善的患者，进行了治疗前和治疗后外周血的采集和PBMCS的分离，应用实时定量PCR，我们分别对20例样品中5个共有差异基因(F8A2、DUSP1、DUSP2、EGR1和FKBP5)的mRNA水平进行了检测，结果显示(图4)，与治疗前相比，基因水平总体下调，尤其FKBP5水平的下调有统计学差异(P=0.001),可能与气虚疾病密切相关。

A：DUSP1表达水平；B：DUSP2表达水平；C：FKBP5表达水平；D：EGR1表达水平；E：F8A2表达水平

3 讨 论

众所周知，中药复方具有多成分、多功效的特点，因此，转录组测序所呈现的差异基因与复方的所有功效相关，无法确定某一特定功效的靶基因。比如，临床中常用的补气类药物，疗效显著的有益气复脉及参芪扶正，补气作用只是它们发挥多种功效中的一种，其中益气复脉为气阴并补制剂，既能补气，又能养阴，常用于心力衰竭及心脏受损等疾病的治疗[9-10]，参芪扶正为补气健脾制剂，既能补气，又能健脾[11-12]，通过对治疗前后的样品进行转录组测序分析，可分别获知与其所有功能相关的基因，即益气复脉注射液治疗后所获得的差异基因，与补气和养阴功能相关；参芪扶正注射液治疗后所获得的差异基因，则与补气和健脾相关，如果只分析其中一个，无法确定哪些基因为与补气相关的基因。考虑到补气是两个制剂共同的中医功效，本研究对它们的差异基因进行韦恩分析，从益气复脉的60个基因和参芪扶正的85个差异基因中，获取了6个共同的差异基因，可判定为与补气相关的候选基因，进一步的一组临床样品分析，证实FKBP5水平的下调，具有统计学差异，说明FKBP5是这两个制剂发挥补气作用的潜在靶基因。

FKBP5(FK506 binding protein 51) 是亲免素蛋白家族成员之一，可与其他蛋白如Hsp90、Hsp70、p23等一起与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)形成复合物[13]，是GR复合物功能的重要调节者[14]。FKBP5可以促使GR复合物转移至细胞核内，进而发挥免疫调节、细胞生存、药物应答等多种功效[15]。此外，FKBP5基因多态性与抑郁发病率密切相关[16]。研究显示，FKBP5高表达水平可以促进抑郁的发生，而抗抑郁药可以下调FKBP5的水平[17]。虽然抑郁并不属于中医范畴的病名，但其临床表现有气虚的症状，这提示补气方药可以通过下调FKBP5水平改善抑郁病人的症状。

另外，GO和KEGG富集的交际分析显示，它们生物功能大都与MAPK信号通路相关。MAPK是一类丝氨酸或者苏氨酸的蛋白激酶，其信号转导途径在介导细胞反应时有着十分重要而广泛的作用，不仅有着“能量开关”的美名，具有调控ATP产生的功效[18],而且可以介导信号通路下游的许多生物过程包括炎症过程,能量代谢,免疫应答等，这些生物过程被认为是许多常见慢性病的重要因素[19-22]，说明补气不仅能改善气虚症状，而且有助于这些慢性病的治疗，提示补气在多种疾病治疗中的重要作用。

综上所述，MAPK信号通路是益气复脉和参芪扶正发挥补气作用的核心通路。FKBP5基因水平下调是它们发挥补气作用的分子标志。