肺泡灌洗液宏基因组二代测序技术在重症肺炎患者中的临床价值*

陈友莲，刘雪燕，陈怀生，洪澄英，张华东

(深圳市人民医院重症医学科，广东 深圳 518020)

由细菌、真菌或病毒引起的肺部感染在世界范围内的发病率和死亡率均逐步上升，是导致总寿命下降的第三大原因[1]。因此需要进行机械通气的重症肺炎死亡率为30%～70%，病原体通常为革兰阴性菌，如不动杆菌属、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌、革兰阳性菌，如金黄色葡萄球菌和肠球菌及一些病毒等[2]。传统的病原体检测方法阳性率低且耗时，不能满足当前对快速和精准感染性疾病诊断的需求[3]。宏基因组二代测序技术(mNGS)是一种高通量测序方法，可以检测病原微生物和标记基因，例如抗生素抗性基因等，检测效率高且周转时间短，从而有可能快速、准确诊断感染性疾病病原体[4]。关于mNGS在重症肺炎患者病原学诊断中的应用报道仍然很少，特别是使用肺泡灌洗液(BALF)样本进行检测的研究。本研究对收治的58例重症肺炎患者的临床资料进行回顾性分析，以探讨肺泡灌洗液mNGS 在重症肺炎患者病原检测及指导治疗方面的临床应用价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析 2019 年 1 月至 2021 年 1 月深圳市人民医院收治的 58 例行支气管镜肺泡灌洗液mNGS检测及传统培养检测的重症肺炎患者的临床资料。重症肺炎诊断标准标准按照2007年美国感染病学会(IDSA)/美国胸科学会(ATS)制定的标准进行诊断[5]。其中男30 例，女28 例；年龄 25～78岁，平均(62.5±12.0)岁。本研究为回顾性研究，肺泡灌洗液标本采集及mNGS检测已得到患者授权家属同意，并签署知情同意书，符合医学伦理学原则，并获得深圳市人民医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集[6]充分做好术前准备，签署知情同意书。根据临床体征及影像学检查确定目标灌洗肺段，2%利多卡因行表面麻醉，根据镜下所见将纤维支气管镜插入至病变最为严重的肺段,分次快速注入 37 ℃ 灭菌生理盐水，每次 25～50 mL灌洗病变肺段支气管,灌洗后负压吸引回收灌洗液(一般回收率为 30%～50%),装入无菌容器中。肺泡灌洗液收集后将其分成2个相等的部分,瓶身标记患者信息，1份样本送至本院的微生物室进行涂片,培养，另1份样本即刻于-20 ℃冰箱保存后立即联系专业人员送往华大基因医学检验实验室行mNGS检测。

1.2.2mNGS病原学检测[7]按上述步骤收集合格样本，提取核酸进行高通量测序，对样本中微生物 DNA 序列进行生物信息学分析得出检测结果，最后临床医生综合检测结果及临床特征进行综合判断，进一步指导临床诊疗。

1.2.3观察指标 观察患者的基线资料，包括年龄、性别、合并基础性疾病、疾病严重程度、器官支持治疗措施、肺泡灌洗液常规培养及mNGS检测病原学分布、抗生素调整、重症监护室(ICU)住院时间、治疗转归等。比较肺泡灌洗液常规培养及mNGS病原体各自检测情况(病原体阳性比例、种类分布、二者吻合程度及多重感染比例等)。

2 结 果

2.1患者基线资料 本研究共计纳入58例患者，其中男性患者为 30 例(51.7%)，患者总体的平均年龄(62.5±12.0)岁，研究对象中有42例患者合并一种甚至多种基础疾病，其中胃肠肿瘤围手术期25例(43.1%)。患者急性生理功能和慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)和序贯器官衰竭评分(SOFA)分别为22、10分，说明患者病情危重。其中纳入有所有患者均为有创机械通气，16例(27.6%)患者进行了俯卧位通气，38例(65.5%)患者出现休克，30例(51.7%)患者需要肾脏替代治疗，8例(13.8%)患者甚至进行了体外膜氧合支持治疗。经mNGS检测后抗生素调整患者有25例(48.1%)。所有患者ICU平均住院时间20.8(7，38)d，死亡率为31.0%(18例)。

2.2肺泡灌洗液 mNGS与传统培养的病原体分布 53例肺泡灌洗液 mNGS 检测阳性患者中，共检测到病原体 209 株，其中细菌有155 株(鲍曼不动杆菌 30株，嗜麦芽窄食单胞菌23株，铜绿假单胞菌 18 株，肺炎克雷伯菌17株，皮特不动杆菌8株，屎肠球菌9株，肺炎链球菌6株，大肠埃希菌6株，粪肠球菌4株，流感嗜血杆菌 3 株，纹带棒状杆菌3株，以及其他包括嗜肺军团菌2株，解甘露醇罗尔斯菌2株，金黄色葡萄球菌2株)，病毒 29株(人类疱疹病毒 1 型 11 株，巨细胞病毒 7 株，细环病毒4株，EB病毒3株)，真菌19株(光滑念珠菌5株，近平滑念珠菌5株，白色念珠菌5株，热带念珠菌 3 株，烟曲霉 1 株)，特殊病原体 11 株(鹦鹉热衣原体2 株，解脲支原体2株耶氏肺孢子菌4株，隐球菌2株，结核分枝杆菌 1 株)。19例培养阳性患者中，共检测到病原体 65株，其中细菌57株(鲍曼不动杆菌 10株，嗜麦芽窄食单胞菌12株，铜绿假单胞菌6株，肺炎克雷伯菌 8株，大肠埃希菌3株等)，真菌15株(光滑念珠菌3株，近平滑念珠菌4株，白色念珠菌5株，热带念珠菌 1 株，烟曲霉1株)。特殊病原体和病毒未检测出。由此可以看出，肺泡灌洗液mNGS对细菌、病毒及特殊病原体的检测阳性率明显高于常规培养检测方法。见图1。

图1 肺泡灌洗液mNGS和常规培养病原学分布

2.3mNGS 阳性率与传统培养灵敏度、特异度、吻合程度比较 肺泡灌洗液mNGS较常规培养的灵敏度提高了约59.0%(92.0%vs.32.3%；P<0.05)，特异度降低了23.7%(58.8%vs.82.5%；P=0.38)。与常规培养相比，mNGS提高了灵敏度(P<0.05)，而二者之间特异度差异无统计学意义(P=0.38)。肺泡灌洗液mNGS和常规检测病原体均为阳性17例(29.3%)，3例(5.7%)均阴性；仅mNGS检出病原体阳性36例(62.0%)，仅肺泡灌洗液培养病原体阳性2例(3.4%)。在17例双阳性病例中，肺泡灌洗液mNGS和常规培养结果完全匹配13例，完全不匹配2例，部分不匹配2例。

2.4肺泡灌洗液mNGS检测混合感染的作用 在58例患者中，肺泡灌洗液mNGS检测未发现病原体有2例(3.4%)，发现仅1种细菌感染有7例(12.0%)，仅1种真菌感染有1例(1.7%)，细菌真菌混合感染13例(22.4%)，细菌病毒混合感染12例(20.7%)，多细菌混合感染14例(24.1%)，真菌病毒混合感染1例(1.7%)。其中细菌真菌病毒混合感染6例(10.3%)，细菌真菌病毒及支原体混合感染2例(3.4%)。结合患者病情及免疫功能指标，作者发现免疫功能正常患者主要为一种病原体感染或细菌合并真菌感染或多细菌合并感染，而在免疫功能抑制的患者中，细菌-真菌-病毒混合性感染比较常见。

3 讨 论

早期病因诊断对于重症肺炎患者合理使用抗生素非常重要。传统的诊断技术主要包括涂片显微镜检查，微生物培养，抗原抗体检测和PCR等这些评估方法耗时、检测范围窄且阳性率低，不能满足重症肺炎患者的诊断需求[8]。随着分子生物学的发展，mNGS检测的价值已逐渐得到认可，特别是对于一些稀有、非典型或生长缓慢的微生物的检测[9]、现有检测技术无法识别的病原体以及对标准化抗菌治疗无效的患者[10]。有研究表明，重症肺炎患者气道菌群组成受机械通气时间的影响，随着发病时间的延长，细菌菌群的类型可能会发生变化，这可能是细菌菌群迁移的结果[11]。而且mNGS可以识别不同条件下的气道菌群分布，有助于迅速和准确的治疗肺部感染[12]。常规检测方法显示，革兰阴性杆菌是最常见的病原体(41%～92%)，如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌、大肠杆菌、变形杆菌等。其次是革兰阳性球菌，如金黄色葡萄球菌、链球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、万古霉素耐药金葡菌(VRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)等。其他的还包括念珠菌等真菌[13]。本研究表明，常规培养与肺泡灌洗液mNGS的检测病菌体分布基本一致，但后者检测灵敏度高于常规培养(91.3%vs.32.3%，P<0.05)，而特异度低于常规培养(58.8%vs.82.5%,P=0.25),且受先前抗生素暴露的影响较小[14]。而且在一些少见病原体(如嗜肺军团菌、纹带棒状杆菌、李斯特菌、耶氏肺孢子菌、隐球菌、鹦鹉热衣原体等)检测方面则更具有优势，可以迅速确诊并进行靶向抗感染治疗。此外，肺泡灌洗液mNGS在检测病毒方面优势非常明显。本研究中，共检测到29株病毒，最常检测到的病毒为单纯疱疹病毒1型11株、巨细胞病毒7株、细环病毒4株，EB病毒3株。既往有研究表明，合并病毒感染重症肺炎患者的预后更差[15]。本研究中，因发现病毒而调整治疗方案约占45%。因此，通过肺泡灌洗液mNGS检测及早识别一些少见、致病性病毒具有非常重要意义，可以帮助我们尽早做出合理的医疗决策。

mNGS的另一个优点是其可以在一次检测中同时检测多种病原体。病程迁延、免疫抑制的患者更有可能成为mNGS的最大受益者，因为这一类患者通常为混合感染[16]。本研究中，多细菌混合感染占24.1%，细菌真菌混合感染占22.4%，细菌病毒混合感染占20.7%，真菌病毒混合感染占1.7%，细菌真菌病毒混合感染占10.3%，细菌真菌病毒及支原体混合感染占3.4%，合计有82.8%病例为混合感染。对于混合感染，联合治疗是常见策略，因此应尽早、动态使用mNGS检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物，实现精准治疗，从而减少不必要和不适当的抗生素使用，避免抗生素滥用和耐药发生[17]。

本研究表明，肺泡灌洗液mNGS在重症肺炎治疗中具有非常重要的作用，但仍然存在一些局限性。(1)除了人类基因组干扰和其他常见问题之外，mNGS结果的解释(即区分定植与感染)仍然存在问题，也是今后需要研究的方向；(2)本研究中未进行肺泡灌洗液RNA病毒检测，有可能漏诊一部分RNA病毒感染患者，降低诊断灵敏度。这可能与目前mNGS检测费用较高有关，随着技术的进步及检测成本降低，这一问题有望解决；(3)目前的肺泡灌洗液mNGS虽然可提供耐药基因检测，但仍无法提供耐药细菌药敏检测等重要信息；(4)本研究为回顾性研究，病例数有限，仍需要更多前瞻性和多中心数据才能得出关于肺泡灌洗液mNGS检测在临床应用确实有效的证据。

综上所述，肺泡灌洗液mNGS能够快速、准确地检测和鉴定病原体，为精准诊断和个性化治疗奠定了基础；此外，在诊断重症肺炎患者混合感染方面也具有明显优势，是一种有前途的临床感染性疾病诊断技术。