艾叶多糖的提取、结构分析与功能的研究进展

何柳，王云鹏，谢卫红，张毅*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068）

艾叶为菊科植物艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Vant.）的成熟叶子，是中国传统的天然植物资源，具有清热止痰、温经止血、调节肠道免疫功能等功效[1]。我国艾蒿植物资源位于世界前列，2020年我国新鲜艾蒿产量为19.2万吨，干艾蒿产量为11.5万吨，主要有蕲艾、赣艾、北艾、祁艾及海艾[2]。艾蒿功能价值高，生长在不同地理位置的艾蒿所富含的微量元素含量相似，其中钾、钙、镁、铁含量较高，能为人体提供必要的微量元素[3-4]。目前，我国对艾叶的加工方式主要以艾灸和直接食用等初级加工为主，艾叶深加工食品缺乏，这种现状可能造成艾叶资源的浪费，因此，艾叶精加工食品意义较大。

艾叶多糖（Artemisia argyi folium polysaccharides，AAFP）是一种存在于艾叶中的杂多糖，属于天然生物大分子物质，其分子量主要分布在6 000 Da以上，由不同摩尔比的木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等单糖组成。研究证实AAFP具有抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等功效，能延缓衰老、增强机体免疫力，在开发新型功能性保健食品方面具有良好的发展潜力，且艾叶多糖功能性产品研究较少。因此，本文对艾叶多糖的提取、结构分析及功能活性的研究现状进行概述，以期为开发艾叶多糖的新型功能性食品提供理论依据。

1 艾叶多糖的提取方法

1.1 热水提取法

热水提取法为传统提取方法，因高温可以加速植物细胞多糖的溶解而被广泛应用。刘军海等[5]研究得出AAFP最佳提取工艺为料液比1∶18（g/mL）、提取温度97℃、提取时间1.25 h、提取3次，多糖的提取率可达1.529%。沈霞等[6]研究得出AAFP最佳提取工艺为料液比1∶20（g/mL）、提取温度 99 ℃、提取时间 2.3 h，多糖的提取率可达3.017%，与理论预测值3.096%的相对误差为2.6%。可知，料液比、提取温度、提取时间和提取次数影响AAFP提取率。

1.2 超声波辅助提取法

超声波是一种弹性机械振动波，因其空化效应、搅拌作用加速有效成分的溶出，提高提取率[7]，采用超声波辅助提取多糖时需注意超声功率对多糖结构的影响，功率过大会破坏多糖的结构。李宏睿等[8]采用超声辅助法提取AAFP最佳工艺为超声处理时间20 min、提取温度 80 ℃、提取时间 2.0 h、料液比 1∶40（g/mL）；此条件下多糖提取率高达11.94%。戴喜末等[9]考察超声法提取野艾蒿多糖的最佳工艺为超声处理时间35min、提取温度 70 ℃、料液比 1∶40（g/mL），在此工艺条件下，多糖提取率为6.44%；与理论预测值6.71%的相对误差为4.02%。说明优化的试验条件比较可靠。可见，艾蒿种类、超声处理时间也影响AAFP的提取率。

1.3 微波辅助提取法

微波是一种能渗入物质深处的电磁波，促使物质吸收微波能量，导致温度升高、压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，从而促进有效成分的溶出[10]。采用微波法提取时应注意微波穿透厚度有限、适应性有限等缺点。赵蔡斌等[11]采用微波辅助热水浸提法得出AAFP的最佳提取工艺条件为料液比1∶20（g/mL）、提取温度 85 ℃、提取时间 20 min、微波功率400 W，在优化条件下艾叶多糖提取率可达2.74%。与热水浸提法相比，提取时间缩短了73%。

1.4 加压溶剂萃取法

加压溶剂萃取法（pressurized solvent extraction，PSE）是采用常规溶剂对固体或半固体样品进行萃取的方法。其原理是在封闭容器内，通过高温高压升高提取溶剂的沸点，从而使提取溶剂仍保持液体状态，避免提取溶剂的挥发，提高提取速率[12]。李华生等[13]通过加压提取AAFP，考察了溶剂浓度、料液比、萃取压力、萃取时间和萃取温度5个因素对提取率的影响，得出最佳工艺条件为溶剂浓度50%、料液比1∶30（g/mL）、萃取压力0.9 MPa、萃取时间40 min、萃取温度120℃。在此试验条件下，艾叶多糖提取率达到6.82%。

1.5 超声波-酶提取法

酶法是利用酶将植物细胞壁降解，使有效成分溶出，从而提高多糖得率的方法[14]。超声波-酶提取法是一种超声波与酶联用提取植物多糖的方法，具有高度特异性，不会破坏艾叶中其他有效成分，一般选择纤维素酶。熊曼萍[15]采用超声波-酶法提取AAFP得出最佳提取工艺条件为纤维素酶处理2 h、料液比1∶40（g/mL）、乙醇浓度80%、超声处理时间30 min，在此条件下多糖得率可达0.790%；同样条件下，单纯的超声波辅助提取AAFP得率为0.504%；表明在相同条件下，超声波酶法提取艾叶多糖得率比超声法提取提高了56.75%，AAFP得率的影响因素强弱排序为乙醇浓度＞料液比＞超声处理时间。

艾叶多糖5种提取方法优缺点如表1所示。

表1 艾叶多糖提取方法优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of polysaccharide extraction from Artemisia argyi folium polysaccharides

由表1可知，热水提取法提取简单但耗时长，通常考察提取温度对AAFP的影响。与传统热水提取法相比，超声波提取法或微波提取法均能大大缩短提取时间、提高提取效率，通常考察功率，功率过高会破坏艾叶多糖的结构，且微波穿透厚度有限、适应性有限等因素对AAFP得率也可能产生不同程度的影响。加压溶剂萃取法自动化程度高、萃取时间短，需考察压力对AAFP结构的影响。超声波-酶提取法温和、环保、提取率高，不仅考察超声波功率的大小，还应利用酶的专一性特点来选择酶。以上5种提取方法各有优缺点。因此，应综合考虑设备条件、提取成本、效率、环保等因素来提取AAFP。

2 艾叶多糖的相对分子量与单糖组成分析

艾叶多糖相对分子量通常指平均相对分子量，测定AAFP的相对分子质量一般采用高效凝胶渗透色谱法（high performence gel permeation chromatography，HPGPC）；多糖的单糖组成分析是进行多糖质量控制的重要依据，测定AAFP的单糖组成方法有高效液相色谱-蒸发光散射法（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）[16]和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[17-18]。AAFP的相对分子量与单糖组成的情况如表2所示。

表2 艾叶多糖相对分子量与单糖组成Table 2 Relative molecular weight and monosaccharide composition of AAFP

续表2 艾叶多糖相对分子量与单糖组成Continue table 2 Relative molecular weight and monosaccharide composition of AAFP

由表2可知，AAFP的分子量和单糖组成存在差异。Lan等[16]从艾叶中分离得到了4种多糖级分；AY10的分子量最大为9 171 Da，单糖组成为木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和鼠李糖，其摩尔比为18.18∶14.91∶37.83∶25.88∶3.20；AY00 的分子量最小为 6 922 Da，单糖组成为木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，其摩尔比为 9.08∶13.38∶24.86∶52.68；可见，AY10 的分子量比AY00大，可能与AY10中含有鼠李糖有关。Bao等[17]从艾叶中得到了一种水溶性多糖FAAP-02，其分子量为5 619 Da，单糖组成为N-d-葡萄糖胺、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和核糖，摩尔比为11.13∶8.09∶6.86∶3.82∶3.12∶2.74∶1.80∶1.00。Tseng 等[20]将艾叶粗多糖通过Vivaspin 20离心管分离得到AAWAP，其平均分子量为4 255 000 Da，单糖组成为葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖醛酸，摩尔比为2.42∶1.00∶0.79∶0.34∶0.25。相比较而言，AAWAP 分子量比FAAP-02分子量大，FAAP-02是纯化分离得到的多糖，表明分离纯化可能对多糖分子量产生影响。

综上所述，AAFP为大分子化合物，其分子量差异较大，单糖组成均含有阿拉伯糖和甘露糖，其摩尔比也存在显著差异，这可能跟AAFP的结构构象有关，后续可深入探讨阿拉伯糖和甘露糖与功能活性的关系。

3 艾叶多糖的功能活性

艾叶多糖属于天然植物多糖，具有抗氧化、免疫调节、降血糖、调节细胞凋亡和抗肿瘤等功效，因毒副作用低、提取方便、保健价值高等优点受到广泛关注。

3.1 抗氧化作用

过量的自由基会加速人体衰老和引起各种疾病的发生，而抗氧化能克服过量的自由基对人体造成的损伤[21]。研究证实植物多糖能清除DPPH·、·OH、ABTS+·和O2-·[22-24]。天然植物多糖对机体无毒副作用[25]，具有成为天然抗氧化剂的潜力。Deng等[26]研究表明AAFP清除ABTS+·、DPPH·、·OH的IC50值分别为74.41、268.5、350.2 μg/mL，铁还原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP） 值为 163.5 μg/mL，FRAP 值越大，抗氧化能力越强，说明AAFP具有很强的抗氧化活性。Lan等[16]研究表明AAFP分离纯化后的亚组分均对氢氧化物以及O2-·显示出高抗氧化能力，IC50值分别为8 μg/mL～18 μg/mL和10μg/mL～30μg/mL。胡岗等[27]研究发现AAFP浓度由0.125 mg/mL增大到4 mg/mL，对·OH和O2-·的清除率分别增加了约2.1倍和1.2倍；当AAFP浓度由2 mg/mL增大到256 mg/mL时，对DPPH自由基清除率增加了约12.8倍，表明AAFP抗氧化活性与其浓度呈正相关；此外，还表明AAFP的抗氧化作用机制：D-脱氧核糖-铁体系法结果表明AAFP在磷酸盐缓冲液中能竞争性地结合Fe2+-EDTA与H2O2反应引发生成·OH，羟胺法结果表明AAFP可与O2-·发生氧化反应，DPPH法结果表明AAFP可直接提供氢离子，从而达到消除自由基的目的[27]。

3.2 免疫调节作用

大量研究表明，细胞因子在对外源和自身抗原的免疫反应中起关键作用[28-32]。白介素-2（nterleukin-2，IL-2）是一种多效性细胞因子[33]，可诱导T细胞分化[34]；I型干扰素不仅作为抗病毒细胞因子，还具有多种针对细菌感染的免疫调节作用[35]。目前，黄芪多糖[36]、铁皮石斛多糖[37]、麦冬多糖[38]、艾叶多糖[16]等植物多糖被证实具有免疫调节作用。其中AAFP调节宿主免疫反应主要与白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-2、肿瘤坏死因子 β（tumor necrosis factor,TNF-β）等细胞因子的活性以及T淋巴细胞的增殖有关。尹美珍等[39]研究发现，AAFP浓度与脾细胞IL-2活性呈量效关系，当浓度在100mg/mL～500 mg/mL时，可明显提高小鼠脾细胞IL-2和TNF细胞因子活性，也可提高腹腔巨噬细胞的酸性磷酸酶活性和吞噬能力，从而发挥免疫调节作用。AAFP是否对巨噬细胞的白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、TNF-α的活性产生影响文献中尚未研究。此外，另有文献探索AAFP体内给药对宿主免疫作用的影响，结果表明AAFP浓度在200mg/mL～600mg/mL范围内，可促进巨噬细胞存在条件下淋巴细胞的增殖，且高于无巨噬细胞存在条件下淋巴细胞的增殖，从而证明了AAFP可显著上调腹膜巨噬细胞的IL-6和TNF-α水平并促进T细胞免疫，具有免疫调节作用[40]。进一步分离纯化得到的AAFP亚组分也具有较强的免疫调节作用，Lan等[16]研究发现，从AAFP分离出的4个亚组分均能增强伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）诱导的T细胞增殖，但不能增强脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的B细胞增殖；此外，AAFP还以剂量依赖性方式显著促进ConA诱导的干扰素-γ（interferon γ，IFN-γ）和 IL-2 的分泌。

免疫调节分为非特异性免疫和特异性免疫，巨噬细胞具有非特异性免疫调节功能[41]，而免疫球蛋白具有特异性免疫调节功能[42]。Zhang等[43]研究发现，AAFP可显著增强免疫球蛋白M（immunoglobulinM，IgM）的含量，且以剂量依赖性方式促进IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，其作用机制可通过上调NO的浓度和特异性促进 IgM、免疫球蛋白 G（immunoglobulinG，IgG）、IL-1β、IL-6和TNF-α抑制剂的分泌进而对体外免疫起重要作用，但AAFP对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、Toll样受体 4（toll-like receptor 4 ，TLR4）、髓样分化因子88和核因子Kappa B（NF-κB）mRNA水平却无显著影响。这说明NO不是通过iNOS活性增加而产生，可能与一氧化氮合酶家族（NOS）催化NO产生有关，一氧化氮合酶家族（NOSs）不仅包括iNOS，还包括内皮型 NOS（eNOS）和神经性 NOS（nNOS）[44]。据报道，多糖的分子机制与Toll样受体介导的信号通路密切相关，其中TLR4已被证明是重要的多糖受体[45]，而AAFP却不能激活TLR4/NF-κB信号通路。综上所述，AAFP发挥免疫调节的作用机制尚不明确，还需进一步深入探究。

3.3 抗肿瘤作用

早在100多年前多糖就参与肿瘤和癌症的辅助治疗[46]。自从Chihara等[47]研究发现香菇多糖的抗肿瘤活性后，越来越多的多糖被分离出来，这些多糖结构多样化，抗肿瘤活性强。与传统的抗肿瘤药物区别在于，多糖能通过激活宿主的各种免疫反应发挥其抗肿瘤作用，且对机体无损害，因此，多糖被视为生物反应调节剂[48]。AAFP的抗肿瘤活性主要表现在直接抑制肿瘤细胞增殖或通过增强机体免疫功能达到抗肿瘤作用。喻昕等[49]研究表明，AAFP与肝癌细胞共孵育能明显抑制肝癌细胞的增殖，与小鼠脾细胞共孵育能明显提高TNF对靶细胞的活性，增强自然杀伤细胞对靶细胞的杀伤力。Bao等[17]研究表明，AAFP能明显抑制S180肿瘤的生长，延长了荷瘤小鼠的存活时间，其主要通过增加胸腺和脾脏指数，提高血清IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α水平以及CD4+和CD8+脾T淋巴细胞的表达，从而提高荷瘤小鼠免疫功能来实现，这表明AAFP的抗肿瘤作用机理与免疫刺激作用有关。

癌症相关的血栓形成是癌症患者常见的并发症，血栓的预防工作非常重要[50]。肿瘤细胞诱导的血小板聚集通过形成血小板“屏蔽层”来保护肿瘤细胞，该“屏蔽层”允许肿瘤细胞耐受免疫细胞的攻击并促进肿瘤细胞的侵袭和转移[51-52]。平足蛋白（podoplanin，PDPN）是I型跨膜唾液酸在多种癌细胞类型中表达的蛋白，在促进肿瘤侵袭和转移中起关键作用[53-54]，PDPN的表达与癌症相关的死亡率高度相关[55]。为寻找PDPN和肿瘤细胞诱导的血小板聚集的拮抗剂，Tseng等[20]研究发现分离出的AAWAP可通过抑制PDPN活性和肿瘤细胞诱导的血小板聚集来预防肿瘤细胞的转移，其作用机制是通过蛋白质印迹和α筛选分析确定AAWAP对细胞和血小板无毒，并且以剂量依赖性方式不可逆转地阻断PDPN和C型凝集素样受体2（c-type lectins2，CLEC-2）之间的相互作用，从而抑制PDPN和肿瘤细胞诱导血小板聚集，达到抗肿瘤活性的目的。上述研究表明，AAFP能阻断保护肿瘤细胞耐受免疫细胞攻击的“保护层”。AAFP是具有抗肿瘤功效的潜在天然保健品。

3.4 其他作用

目前研究还发现AAFP还具有抗菌[56]、降血糖[57]以及调节小鼠胸腺细胞凋亡作用[19]。如Kyung等[19]研究发现，分离纯化的AAFP寡糖级分AVF3可通过抑制Fas基因的表达来调节胸腺细胞凋亡；Fas及其配体FasL能够诱导细胞发生凋亡，FasL为能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，是有关细胞凋亡的膜表面分子[58]；其作用机制可能是AVF3通过下调Fas/FasL基因表达活性来促进小鼠胸腺细胞的存活。艾叶多糖的作用机制如图1所示。

图1 艾叶多糖的作用机制Fig.1 Mechanism of Artemisia argyi folum polysaccharides

综上所述，艾叶属于中国传统天然植物，AAFP具有以上多种功能活性，且安全无毒，被视为生物反应调节剂。目前有关AAFP抗氧化、免疫调节和抗肿瘤的研究较为深入，主要是通过机体信号通路来发挥作用。但尚不明确AAFP结构构象与功能活性之间的关系，AAFP活性是否与其分子量、单糖组成和微观结构等因素有关，还需要进行大量研究来证实。明确AAFP功能活性与结构之间的构效关系，对开发艾叶多糖新型功能性食品至关重要。此外，还可进行化学修饰来提高AAFP的功效，制备艾叶多糖衍生物，从而开发更多新型功能性产品。

4 总结与展望

我国艾蒿植物资源丰富，艾叶深加工食品缺乏，可能造成艾叶资源的浪费。艾叶多糖是存在于艾叶中的杂多糖，安全无毒、提取方便，具有抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等功效；因此，艾叶多糖的研究与开发意义较大。目前，有关艾叶多糖的研究取得了相关进展，但仍存在一些问题：1）艾叶多糖提取率存在差异，提取方法不适用于工业化提取。2）艾叶多糖结构研究较少，现阶段还停留在初级结构研究，有关艾叶多糖分子空间构象、分子间相互作用、糖苷键连接方式和微观结构等方面未深入研究。3）艾叶多糖功能活性与结构之间的关系尚不明确。上述问题限制了艾叶多糖新型功能性食品的开发，因此，为提高艾叶资源有效利用率，后续应从提取方法、结构鉴定和功能活性展开深入研究，从而得到最佳提取工艺和明确多糖的构效关系，为开发艾叶多糖新型功能性食品提供理论依据，使艾叶多糖新型食品满足人们的需求。