瘦素对猪原代脂肪细胞脂滴相关基因mRNA 表达的影响*

何永江，肖 慧，黄 英，杨明华，赵素梅，潘洪彬，刘 琛，彭泽琴

（1.云南农业大学 动物科学与技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南 昆明 650201；2.迪庆藏族自治州民族中等专业学校，云南 迪庆 674499；3.滇西科技师范学院 生物技术与工程学院，云南 临沧 677000）

脂肪细胞承担机体的能量存储及供给，以甘油三酯（triglyceride，TAG）为主要形式储存能量，TAG 脂解为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）和甘油向外周细胞供给能量[1]；脂肪细胞作为内分泌细胞分泌肿瘤因子和瘦素（leptin，LEP）等脂肪因子[2]。LEP 通过下丘脑途径和外周途径调节脂代谢，抑制外周脂肪合成并调节食欲，从而促进机体质量减小[3]。同时，LEP 在机体质量减小后抑制利于机体质量恢复的代谢、自主神经、神经内分泌和行为适应[4]。

脂滴（lipid droplets，LDs）作为第二细胞器，参与脂质的储存、脂解和内质网应激反应[5]。LDs 在内质网形成，其表面由单层磷脂和各类蛋白质包裹，形成过程中LDs 的转运和TAG 的分配通过诱导脂肪沉积跨膜蛋白（fatstorage-inducing transmembrane protein，FITM）介导，从内质网释放进入细胞质[6]。大多数真核生物中，FITM1主要在肌肉组织表达，FITM2 表达于全身各组织。脂滴包被蛋白1（perilipin 1，PLIN1）在脂肪细胞的脂解和脂质储存调节中起重要作用[7]，基础状态下PLIN1 作为LDs 屏障阻止脂肪酶介导的TAG 脂解[8]，脂解刺激下PLIN1 磷酸化[8-9]，促进脂解过程。脂滴包被蛋白2（perilipin 2，PLIN2）是一类脂滴蛋白，利于抑制胰岛素拮抗和TAG 沉积，促进参与小鼠肝脏脂肪和胆固醇生物合成途径相关的SREBP-1和SREBP-2靶基因表达[10]。成熟脂肪细胞中，基础状态下多数PLIN2 通过泛素—蛋白酶途径降解，极少部分定位在LDs 表面[11]。在嵌合蛋白作用下，定位于LDs 表面的PLIN2 N 端与PLIN1 C 端发生融合，维持LDs 与脂肪酶激活因子α/β 水解酶结构域蛋白5（comparative gene identification-58，CGI-58）的相互作用，抑制基底脂解[12]。研究表明：LEP在皮下前脂肪细胞中可调控脂类代谢相关基因的表达，调节脂肪细胞TAG 水解和游离脂肪酸的氧化[13-15]，但目前关于LEP 对细胞脂滴相关基因表达的研究较少。

本研究以猪原代脂肪细胞为材料，通过不同质量浓度LEP 处理猪原代脂肪细胞，以TAG 含量以及PLIN1、PLIN2和FITM2mRNA 表达水平为分析指标，探究LEP 对脂滴相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物及处理

麻醉放血处死3 头15 日龄健康状况良好的三元杂交仔猪（Duroc×Landrace×Yorkshire，DLY），取背部皮下脂肪。试验动物来自云南农业大学实验猪场。

1.2 猪原代脂肪细胞分离培养及诱导分化

参照李永能等[15]对猪皮下脂肪细胞处理的方法并混合所得脂肪细胞，用基础培养基进行猪皮下脂肪细胞分离培养，向诱导分化培养液中添加不同质量浓度LEP（0、50、100 和150 ng/mL）诱导分化猪原代脂肪细胞48 h。在细胞培养第1 和5 天采集细胞图片，并对加入不同质量浓度LEP 诱导分化48 h 后的细胞进行油红O 染色，观察细胞分化结果。

1.3 TAG 含量测定

通过氧化酶法对不同质量浓度LEP 处理的猪原代脂肪细胞进行TAG 测定，操作步骤严格按照甘油三酯试剂盒-TG（酶法）（北京北化康泰临床试剂有限公司，北京）说明书进行。

1.4 总RNA 提取及测定

分别收集0、50、100 和150 ng/mL LEP 处理48 h 后的猪原代脂肪细胞，用总RNA 提取试剂盒（离心柱型）[ 天根生化科技（北京）有限公司，北京 ]提取总RNA，每个处理做3 次平行；采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 完整性，通过分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美国）测定总RNA 含量与纯度。

1.5 qPCR 表达分析

根据测定的总RNA 含量，取2 µg 总RNA，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（全式金生物技术有限公司，北京）进行反转录，反应体系20 μL：总RNA 2 µL，Anchored Oligo（dT）181 µL，2×TS Reaction Mix 10 µL，RNase-free water 补全体系；反应条件为：37 ℃反转录60 min，95 ℃灭酶活5 min，其他操作参照说明书进行。反转录产物于-20 ℃冰箱保存。目的基因FITM2、PLIN1和PLIN2以及内参基因18S rRNA 引物根据GenBank 猪的基因序列，采用Primer Primer 5.0 软件设计，由上海生物工程有限公司合成，引物登录号及引物序列见表1。qPCR 反应体系为20 µL：反转录产物1.5 μL，SYBR®Premix ExTaqTM（宝生物工程有限公司，大连）10 µL，上、下游引物各0.4 µL，ddH2O 补全体系至20 µL。经不同质量浓度LEP 处理所得细胞各做6 次重复，同时用ddH2O 代替反转录产物和SYBR®Premix ExTaqTM中含有的荧光试剂，排除外源基因和基因组DNA 污染。反应程序为：预变性94 ℃ 30 s，94 ℃变性5 s，退火30 s，延伸72 ℃ 10 s，共35 个循环，72 ℃延伸10 min。18S rRNA 基因退火温度为55 ℃；PLIN1、PLIN2和FITM2基因退火温度为60 ℃。

表1 内参基因与目的基因的引物序列、产物长度和登录号Tab.1 Primer sequence,product length and entry number of reference gene and target gene

1.6 数据分析

各处理组基因相对表达水平以内参基因18S rRNA 为参照，计算不同质量浓度LEP 处理下PLIN1、PLIN2和FITM2的相对表达量。TAG 含量和qPCR 数据经初步分析，选择单因素方差分析模型进行计算：

式中：TAGij为第i水平处理时细胞的TAG 含量，GENEij为第i水平处理时基因的表达水平；µ为基因表达水平的总体平均数；LEPi为LEP 处理的第i个效应；eij为试验误差）。

采用SAS 9.2 软件对试验数据进行单因素方差分析和描述统计分析，方差分析结果通过Duncan 法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 脂肪细胞形态学观察

诱导分化前，细胞呈成纤维状（图1）；猪原代脂肪细胞诱导分化48 h，经油红O 染色，LDs 呈深红色（图2）。说明本试验分离细胞为脂肪细胞。

图1 原代脂肪细胞观察结果 (100×)Fig.1 Observation results of primary adipocytes

图2 油红O 染色结果 (400×)Fig.2 Results of oil red O staining

2.2 不同质量浓度LEP 对猪原代脂肪细胞TAG含量的影响

由图3 可知：与0 ng/mL LEP 组相比，50和100 ng/mL LEP 可显著增加猪原代脂肪细胞TAG 含量（P＜0.05）；与50 和100 ng/mL LEP 组相比，150 ng/mL LEP 可显著降低猪原代脂肪细胞TAG 含量（P＜0.05）。

图3 不同质量浓度LEP 下原代脂肪细胞TAG 含量Fig.3 TAG content of primary adipocytes at different LEP mass concentrations

2.3 不同质量浓度LEP 对PLIN1、PLIN2 和FITM2 基因mRNA 表达的影响

由图4 可知：与0 和150 ng/mL LEP 组相比，50 和100 ng/mL LEP 可显著抑制PLIN1基因mRNA 相对表达（P＜0.05）；与0 和50 ng/mL LEP 组相比，100 和150 ng/mL LEP 可显著促进PLIN2基因mRNA 相对表达（P＜0.05），LEP 呈质量浓度依赖性上调PLIN2基因mRNA 表达的趋势；与0 ng/mL LEP 组相比，50 和100 ng/mL LEP可显著促进FITM2基因mRNA表达（P＜0.05），同时100 ng/mL 为LEP 促进FITM2基因表达的最佳质量浓度。

图4 不同质量浓度LEP 下PLIN1、PLIN2 和FITM2基因相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of PLIN1,PLIN2 and FITM2 genes at different LEP mass concentration

3 讨论

3.1 不同质量浓度LEP 对猪原代脂肪细胞TAG含量的影响

LEP 由白色脂肪组织分泌，调节脂代谢平衡，脂代谢紊乱时，机体脂肪合成增加以及分泌功能改变[2]。LEP 通过间接抑制葡萄糖氧化和脂肪生成，减少对胰岛素介导的脂肪刺激，抑制脂肪酸酯化的同时刺激脂肪酸氧化[16]。相关研究[13-15]表明：LEP 促进猪皮下脂肪细胞TAG 水解，降低猪皮下脂肪细胞中的TAG 含量。此外，TOKGÖZ 等[17]调查发现：肥胖青少年血液LEP 水平与肥胖具有正相关性；相关研究[18]通过LEP 治疗精神病患者肥胖，患者血清LEP 水平升高，患者皮下脂肪沉积减少。上述研究表明：不同质量浓度LEP 对脂代谢调节作用存在差异。

本研究发现：LEP 对猪原代脂肪细胞脂代谢的调节作用存在质量浓度差异。50 和100 ng/mL LEP 促进猪原代脂肪细胞中TAG 沉积；当LEP达150 ng/mL 时，LEP 可促进猪原代脂肪细胞中TAG 脂解（与50 和100 ng/mL LEP 组比较）或对猪原代脂肪细胞TAG 含量无显著影响（与0 ng/mL LEP 组比较）。本试验通过不同质量浓度LEP 处理猪原代脂肪细胞得到不同的结果，原因可能为150 ng/mL LEP 触发了脂肪细胞的LEP 拮抗[19]，使猪原代脂肪细胞对LEP 敏感性降低，导致猪原代脂肪细胞中TAG 含量无明显变化。

3.2 不同质量浓度LEP 对脂滴相关基因mRNA表达的影响

机体内脂类物质由循环系统运输至各组织细胞，在细胞内以LDs 的形式沉积。FITM2 负责LDs 生产过程中TAG 的分配以及LDs 成熟后由内质网释放进入细胞质的转运[5-6,20]。CHOUDHARY 等[5]测定哺乳动物中FITM2表达时发现：FITM2参与TAG 分配，但与TAG 合成无关；过表达FITM2基因，细胞中中性脂质含量急剧增加。本研究表明：50 和100 ng/mL LEP 在增加猪原代脂肪细胞TAG 含量的同时显著上调FITM2基因表达水平，而150 ng/mL LEP 对猪原代脂肪细胞TAG 含量以及FITM2基因表达无显著影响。以50 和100 ng/mL LEP 组为参照，结合上述研究结果，表明FITM2基因表达水平的上升与原代脂肪细胞TAG 沉积相关。

PLIN1 作为脂滴表面蛋白，对脂代谢具有双向调节作用。一方面，PLIN1 作为LDs 屏障，通过黏附在LDs 表面阻止脂肪酶直接接触LDs中的TAG，起到保护LDs 免受脂解的作用[9,21]；同时，PLIN1 的脂解活性受PLIN1基因甲基化[22]和PLIN1 蛋白磷酸化[11]的影响，抑制或促进脂解反应发生。研究证明：PLIN1基因表达有利于机体沉积TAG；PLIN1基因缺乏则表现出更多且更小的LDs，导致LDs 与酶的接触面积增加，促进脂解[21]。本研究发现：当LEP质量浓度升高至50 和100 ng/mL 时，猪原代脂肪细胞TAG 含量显著增加，降低PLIN1基因的表达水平；当LEP质量浓度继续升高至150 ng/mL 时，猪原代脂肪细胞中TAG 含量显著低于50 和100 ng/mL 组，而细胞PLIN1基因表达水平随着LEP 质量浓度的逐渐升高表现出递增的趋势，与0 ng/mL 组PLIN1基因表达持平。负调控细胞中PLIN1基因表达能够抑制或促进细胞TAG 沉积[8,21]，但PLIN1基因对细胞TAG 代谢可能存在物种差异性。本研究所得结果与利用小鼠[21]和人[22]脂肪细胞作为研究材料所得的结果存在差异，不同的研究方法可能是本研究中PLIN1基因表达水平与细胞TAG 含量结果出现差异的原因。

高能量饮食饲喂条件下，PLIN2基因缺失小鼠避免了高脂饮食导致的肥胖[10]。此外，TAKAHASHI 等[11]诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞，用慢病毒介导脂肪细胞PLIN2基因敲除，发现缺失PLIN2基因的小鼠分化细胞脂解过程时间依赖性减弱。本研究表明：LEP 诱导猪原代脂肪细胞TAG 生成过程中，PLIN2基因表达呈现上升趋势，并且随LEP 质量浓度的升高，PLIN2基因表达随之上升。可见，PLIN2对细胞脂解过程的调控具有双向性。结合本研究结果，表明猪原代脂肪细胞PLIN2基因的表达在一定程度上与LEP 质量浓度正相关，且LEP 质量浓度为0～100 ng/mL 时，PLIN2基因表达表现为促进原代脂肪细胞沉积TAG，而LEP 质量浓度达到150 ng/mL 时，PLIN2基因表达表现为促进细胞水解TAG。

4 结论

LEP 调节猪原代脂肪细胞脂滴相关基因表达具有质量浓度差异性。50 和100 ng/mL LEP 促进猪原代脂肪细胞中TAG 的沉积，而150 ng/mL LEP 促进其降解；LEP 促进TAG 沉积过程中，LEP促进FITM2和PLIN2基因表达，降低PLIN1基因表达；LEP 促进脂解过程中，LEP 促进PLIN2基因表达，并有上调PLIN1基因表达的趋势。