蝗虫肠道纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建

金裕华，康 薇，郑 进，胡长洪，邹 涛*

(湖北理工学院 a.化学与化工学院，b.矿区环境污染控制与修复湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003)

秸秆资源丰富，但大多尚未得到充分有效的利用。其主要成分是纤维素[1]，因而纤维素降解是秸秆利用的关键。目前，一般采用物理、化学和生物法处理秸秆，其中利用微生物降解纤维素具有成本低、绿色无污染、高效等优点[2]。微生物对纤维素的降解主要是通过向胞外分泌纤维素酶来催化降解纤维素。细菌分泌的纤维素酶大多是胞内酶，真菌分泌的纤维素酶大多是胞外酶。真菌、放线菌的纤维素酶分泌能力普遍高于细菌，但细菌繁殖快[3]。目前，微生物降解纤维素的关键在于筛选高效纤维素降解菌。食性昆虫后肠是纤维素降解菌筛选的良好来源。本文从东亚飞蝗后肠中筛选出高效降解纤维素菌株，采用形态学对筛选的高效菌株进行初步鉴定，并将几株高效菌进行复配，构建纤维素降解复合菌系，通过纤维素降解率和产酶能力反映各复配体系纤维素降解效果，旨在为麦秸秆还田提供菌株材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品

供试昆虫：东亚飞蝗成虫，2019年4月购于淘宝，实验前断食1 d，排除肠道食物残渣。

1.1.2培养基

液体富集培养基[4]：选择羧甲基纤维素钠作为唯一碳源，10 g/L CMC—Na，0.001 g/L FeSO4·7H2O，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.5 g/L NaNO3，0.02 g/L硫酸链霉素，pH=7.2。

CMC—Na培养基[5]：5 g/L CMC—Na，0.5 g/L MgSO4，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，12 g/L琼脂，其自然pH=5.5～6.0。

纤维素刚果红培养基参考文献[6]配制，滤纸分解培养基和秸秆分解培养基参考文献[3]配制，真菌培养基(马丁式培养基)、LB培养基、PDA培养基参考《微生物学实验教程》(周德庆、徐德强主编，3版，高等教育出版社)配制。

1.2 方法

1.2.1纤维素降解菌的初筛

参考文献[7]中的方法解剖蝗虫。将蝗虫浸于70%的酒精中灭菌7～8 min使其死亡，移至超净工作台中已灭菌的培养皿里，剪去足与翅，用剪刀从背部肛门剪至胸部，用解剖针和镊子取出消化道，将其置于事先灭菌的研钵中研磨。加入10 mL无菌水制成菌悬液，再取1 mL菌悬液按10倍浓度梯度依次稀释至10-7。分别取稀释100，1 000，10 000，100 000，1 000 000，10 000 000倍的菌悬液各0.2 mL于CMC—Na培养基平板上涂布均匀，静置30 min，倒置于30 ℃恒温恒湿培养箱中培养5 d。将CMC—Na培养基平板上长势良好的单菌落接种于液体发酵培养基中，30 ℃，120 r/min 摇床富集培养 7 d。对富集后的菌株进行划线、传代、纯化，对纯化后的菌株进行编号和保藏。

1.2.2纤维素降解菌的复筛

对CMC—Na分解能力的测定：挑取纯化后的细菌和放线菌单菌落在纤维素刚果红培养基上点样，于30 ℃避光培养15 d，观察各菌株透明圈的大小。

对滤纸分解能力的测定：将纯化后的细菌和放线菌进行液体发酵培养，取5 mL菌悬液到滤纸分解培养基中，30 ℃，120 r/min摇床培养7 d，以滤纸的断裂程度评价菌株对纤维素的降解效果。

1.2.3复合菌系的构建及对小麦秸秆降解能力的测定

引入一株真菌(该真菌为研究小组之前竹林表土中筛选所得，还未鉴定)与蝗虫肠道中筛选出的纤维素降解能力较强的放线菌和细菌构建高效纤维素降解菌的复合菌系。将复合菌系和滤纸崩解实验得到纤维素降解能力较强的菌株分别接入到以小麦秸秆为唯一碳源的培养基中，37 ℃，120 r/min摇床培养，重复3次实验。10 d和20 d后，分别取秸秆，测量秸秆的降解率，并测定秸秆红外光谱吸收图。取出发酵7 d的未降解秸秆，烘干计算，测定菌株的实际降解能力；另于4，7，10，13，16，19 d后，分别去发酵液，测定滤纸纤维素酶活性和漆酶活性。

1.2.4菌株鉴定

利用瑞氏姬萨姆染色鉴定菌株形态，经显微镜(1 000×)观察。采用16SrDNA的PCR产物测序的方法进行分子鉴定。

1.2.5酶活的测定

纤维素全酶活测定方法参考文献[8]，ABTS法测定漆酶酶活参考文献[9]。

1.2.6红外测定

为了解小麦秸秆的降解机理，采用PerkinElmer Spectrum Two红外光谱分析菌株和复合菌株处理10 d和20 d的小麦秸秆。用小型粉碎机将秸秆打碎后过200目筛，取少量样品粉末放入研钵中，加入溴化钾研磨均匀后压片，在PerkinElmer Spectrum Two红外光谱仪上进行观察，每个样品重复检测3次，吸收波长范围为450～4 000 cm-1。

1.2.7数据统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan检验，P<0.05，利用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选分离

以羧甲基纤维素钠为唯一碳源进行初筛，获得细菌6株，放线菌1株，再通过刚果红培养基和滤纸分解培养复筛。菌株刚果红水解圈效果如图1所示，培养7 d菌株对滤纸的降解效果如图2所示。发现1号菌和4号菌有明显的水解圈，且其滤纸分解培养基中的大部分滤纸转化为小碎片，说明这2株菌对纤维素和木质素都有显著降解作用，其表达的各种酶的协同作用较强。

(a) 1号菌 (b) 4号菌

(a) 1号菌 (b) 4号菌

2.2 高效降解纤维素菌株的鉴定

2.2.1菌落形态分析

菌株瑞氏姬萨姆染色效果(1 000×) 如图3所示，菌落形态特征如图4所示。1号菌菌落中间灰色，外围白色，表面呈粉状，初步鉴定为链霉菌，是革兰氏阳性菌。4号菌为杆状，菌落粘稠不易断裂，在培养基上呈地衣状，初步鉴定为黄杆菌，是革兰氏阴性菌。

(a) 1号菌 (b) 4号菌

(a) 1号菌 (b) 4号菌

2.2.216SrDNA基因分析

对1号菌、4号菌的16SrDNA的PCR产物进行测序，与公共数据库NCBI进行DNA序列同源性比较，并对其同源序列用MEGA6软件构建菌株的系统进化树。1号菌和亲缘菌株的系统进化树如图5所示，4号菌和亲缘菌株的系统进化树如图6所示。

图5 1号菌和亲缘菌株的系统进化树

图6 4号菌和亲缘菌株的系统进化树

BLAST比对结果表明菌株1与Streptomycesgriseus有99%同源性，4号菌与Flavobacteriumjohnsoniae有99%同源性。结合微观形态和菌落形态初步鉴定1号菌为链霉菌属灰色链霉菌，4号菌为黄杆菌属短黄杆菌。

2.3 复合菌株对小麦秸秆的降解能力

通过滤纸崩解实验及水解圈实验，综合考虑，选择纤维素降解效果好的放线菌1号菌和细菌4号菌，引入真菌7号菌构建高效纤维素降解复合菌系。分别对1，4，7号和复合菌系进行小麦秸秆发酵，验证复合菌系纤维素降解能力。不同菌系对小麦秸秆的降解率如图7所示。

图7 不同菌系对小麦秸秆的降解率

由图7可知，1号菌的降解率为22%，4号菌的降解率为17%，复合菌的降解率高达35%。这说明复合菌体系中3株菌对秸秆分解起协同增效作用，此复合菌体系的构建具有一定的应用研究价值。

3 复合菌系降解小麦秸秆的机理

3.1 小麦秸秆降解过程中的FTIR图谱分析

1号菌降解小麦秸秆的FTIR图谱如图8所示，不同菌系降解小麦秸秆20 d后的FTIR图谱如图9所示。

图8 1号菌降解小麦秸秆的FTIR图谱

图9 不同菌降解小麦秸秆20 d后的FTIR图谱

综合来说，小麦秸秆发酵时，4号菌和复合菌对纤维素的降解作用较好，对木质素的分解效果甚微；1号菌和7号菌对纤维素、木质素分解能力要比4号菌和复合菌系的好，且对木质素的降解效果尤为显著。小麦秸秆降解过程中，发生主要结构变化的是纤维素、半纤维素和木质素，具体为纤维素被分解后，蜡质层表面逐渐脱落，木质素的苯环结构得以裸露，苯环在纤维素降解菌的作用下裂解，使木质素进一步降解。

3.2 小麦秸秆降解过程中酶活性变化

纤维素酶活和漆酶酶活随时间的变化曲线分别如图10、图11所示。由图10可知，4种菌发酵处理的纤维素酶活在第4～19 d内的变化趋势类似，基本呈下降趋势，且变化不明显，说明纤维素降解启动较早，在4 d左右降解最活跃。此外，可发现1号菌发酵7 d后纤维素酶活性显著高于其他处理；7号菌从13 d开始上升趋势明显，19 d时纤维素酶活性显著高于其他处理。

图10 纤维素酶活随时间的变化曲线

图11 漆酶酶活随时间的变化曲线

由图11可知，漆酶活性随时间的变化趋势各不相同，其中1号菌、4号菌和复合菌在第4 d时漆酶酶活与7号相比较高，且很快下降。7 d后，1号菌、7号菌和复合菌的漆酶活性明显上升，而4号菌无明显的上升趋势。7号菌的漆酶酶活一直呈上升趋势，且到第16 d超过1号菌的漆酶酶活，复合菌的漆酶活性在7 d后基本和7号菌持平，说明小麦秸秆木质素的降解活动主要在16 d左右最活跃。

4 结论

从蝗虫肠道中筛选出高效纤维素降解菌，并构建高效纤维素降解复合菌系，复合菌对小麦秸秆的降解率最高可达35%。小麦秸秆降解过程中，各菌株先产生水解酶分解纤维素和半纤维素，此时纤维素酶活较高，当漆酶酶活逐渐升高时，秸秆蜡质层表面逐渐脱落，木质素的苯环结构得以裸露，苯环在纤维素降解菌的作用下裂解，使木质素进一步降解。