基于网络药理学分析四君子汤治疗结直肠癌的作用机制

葛韵芝，许 寅，丁 超

上海市公共卫生临床中心,上海 201508

结直肠癌是男性癌症死亡的第三和女性癌症死亡的第二大原因［1-3］。由于该病病程隐匿，在临床上，大多数结直肠癌患者直到Ⅱ～Ⅲ期才得到确诊［1］，这使得结直肠癌难以在早期被干预。因此，手术与药物化疗仍然在结直肠癌治疗中发挥重要作用［4］。近年来，结直肠癌患者的五年生存率未见明显提升［5］。目前，研究表明，中药单用或联合化疗药物可以改善结直肠癌患者生存与生活质量［6］。四君子汤，见于宋代《太平惠民和剂局方》，用于脾胃气虚证，近年来常被用于结直肠癌的临床治疗［7-9］。作为补气健脾的经典方，由人参、白术、茯苓、甘草组成。研究表明，其能改善结直肠癌患者血清血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）与酸性成纤维生长因子（acid fibroblast growth factor，aFGF）水平［8］；影响结肠癌细胞超微结构和端粒长度［10］；改善结肠癌患者细胞凋亡及肠道屏障恢复情况［11］。然而，由于中药复方成分复杂，四君子汤对结直肠癌疗效的分子机制尚不清楚。

作为中医研究的新领域，网络药理学可以通过使用建立中药复方化合物靶标网络并进行网络拓扑分析等手段从系统的角度阐明中医药的作用机制［12-13］。在本研究中，我们通过网络药理学网络拓扑分析、富集分析及鲁棒性分析等方法对四君子汤治疗结直肠癌的潜在作用机制进行了研究，为其临床应用与药物开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）、中医药资料库（traditional Chinese medicine database，TCM database@Taiwan）、中医综合数据库（traditional Chinese medicine integrative database ，TCMID）、中药潜在靶点预测平台（traditional Chinese medicine potential target database，TCMPTD）与草药成分和靶点数据库（herbal ingredients'targets database，HIT）用于中药复方四君子汤的化合物与靶标收集，数据纳入条件为生物利用度（oral bioavailability，OB）大于30% 及类药性（druglikeness，DL）大于0.18；OMIM 数据库、DisgeneT 数据库与GeneCard 数据库用于结直肠癌靶标收集，数据纳入关键词为结直肠癌；String数据库用于分析蛋白质-蛋白质互相作用（proteinprotein interaction，PPI），筛选分数为0.850；Reactome 数据库、Omicsbean数据库和DAVID数据库用于进行KEGG和GO（gene ontology）富集分析，纳入标准为P＜0.05；Cytoscape 3.2.1 软件用于四君子汤化合物-靶标网络构建及网络拓扑参数分析。数据库及软件信息见表1。

表1 数据库及软件信息

1.2 四君子汤化合物-靶标网络构建及网络药理学分析使用Venn 分析工具选取四君子汤与结直肠癌的共同靶标。使用“Cytoscape 3.2.1”软件构建四君子汤治疗结直肠癌的化合物-靶标网络。使用“Cytoscape 3.2.1”软件中的Network Analyzer 工具对该化合物-靶标网络进行分析，导出并计算网络中各个节点的相关拓扑参数，包括：节点度（degree）、介数中心性（betweenness centrality）、紧密中心性（closeness centrality）以及拓扑系数（topological coefficient）。依据SHI［14］等人的方法，使用Venn 分析工具选取并保留4种参数皆在前50%的节点。

1.3 四君子汤化合物-靶标核心网络构建及富集分析用“Cytoscape 3.2.1”软件将“1.2”项中保留的节点进行四君子汤化合物-靶标核心网络的构建。将化合物所关联的靶标进行京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本体（gene Ontology，GO）富集分析。

1.4 四君子汤化合物-靶标核心网络构建中化合物贡献分析在四君子汤化合物-靶标核心网络中将不同化合物敲除，通过“Cytoscape 3.2.1”软件中的“Network Analyzer”工具，使用LIU［15］等的方法对化合物敲除后的四君子汤化合物-靶标核心网络进行鲁棒性R 值分析。将化合物以鲁棒性R 值排序，评估化合物在网络中的贡献程度以选取四君子汤治疗结直肠癌的潜在关键化合物并分析四君子汤的潜在作用机制。

1.5 四君子汤治疗结直肠癌的潜在关键化合物分析及通路比较将“1.4”项中得到的关键化合物所关联的靶标进行KEGG 和GO 富集分析。将关键化合物的信号通路及生物功能与四君子汤的信号通路及生物功能进行比较，分析预测四君子汤治疗结、直肠癌的潜在关键化合物组合及四君子汤的潜在作用机制。

2 结果

2.1 化合物靶标收集及四君子汤化合物-靶标网络通过数据库检索及Venn 分析工具，共搜集四君子汤中化合物217个、四君子汤化合物靶标305个和结直肠癌靶标1349 个。建立四君子汤化合物-靶标网络，该网络包括四君子汤化合物119个、四君子汤与结直肠癌的共同靶标156 个。该网络含275 个节点与1716 条边，平均节点度为12.85，其中化合物平均节点度为15.84，靶标平均节点度为10.79。见图1。

图1 四君子汤化合物-靶标网络

2.2 四君子汤化合物-靶标核心网络如图2A所示，使用Venn 分析工具对化合物-靶标网络中节点的节点度、介数中心性、紧密中心性及拓扑系数进行分析，共保留4 种参数皆在前50% 的节点40 个。如图2B 所示，建立四君子汤化合物-靶标核心网络，该网络包括四君子汤化合物7 个、核心靶标33 个。该网络含40 个节点与70 条边，平均节点度为4.24，其中化合物平均节点度为10，靶标平均节点度为2.69。七种化合物分别为高丽槐素、罗通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇与人参皂苷rh2。使用Omicsbean和DAVID工具对该网络中的四君子汤治疗结直肠癌核心靶标进行KEGG 及GO 的富集分析，保留排名前10 的条目，结果见图3。四君子汤治疗结直肠癌核心靶标富集分析结果分为信号通路分析、生物进程分析、分子功能分析与细胞组分分析，其中得到的主要信号通路有PI3K-Akt 信号通路、雌激素信号通路及VEGF 信号通路等；主要生物进程有对含氧化合物的反应、对细胞进程的调控及对脂质的反应等；主要分子功能包括蛋白质二聚化活性、酶结合与蛋白质结合等；主要细胞组分有膜区响应、神经元投射及细胞投射等。

图2 网络拓扑参数分析

2.3 四君子汤治疗结直肠癌核心化合物分析使用鲁棒性R值评价，敲除7种化合物对四君子汤化合物-靶标核心网络稳定性的影响，并进行排序，见表2。选取对网络稳定性影响较高的4 种化合物进入后续分析，指示其对四君子汤化合物-靶标核心网络的稳定性贡献最大。见图3。4 种化合物为高丽槐素、罗通定、山萘酚和常春藤皂苷元。4 种化合物及其靶标分别治疗结直肠的化合物-靶标网络见图4。

图4 4种化合物治疗结直肠癌的化合物-靶标网络

表2 7种化合物对网络稳定性的影响

图3 四君子汤治疗结直肠癌核心靶标富集分析结果

2.4 四君子汤治疗结直肠癌的药理机制预测4种化合物与四君子汤治疗结直肠癌的共有信号通路、生物进程、分子功能与细胞组分见图5。主要共有信号通路包括PI3K-Akt 信号通路、cGMP-PKG信号通路及PPAR 信号通路；主要共有分子功能有药物结合；主要细胞组分有质膜区响应与神经元影响。4 种化合物与四君子汤治疗结直肠癌的潜在信号传导途径与药理机制预测见图6。我们预测四君子汤及其核心化合物高丽槐素、罗通定、山萘酚与常春藤皂苷元能够通过调节PI3K-Akt 信号通路、cGMP-PKG 信号通路及PPAR 信号通路影响生物体脂代谢、细胞生存、细胞周期及细胞凋亡进而参与结直肠癌的治疗。

图5 4种化合物与四君子汤治疗结直肠癌的共同富集分析结果

图6 4种化合物与四君子汤治疗结直肠癌的潜在信号传导途径与药理机制预测

3 讨论

由于结直肠癌病理机制复杂且治疗困难，针对结直肠癌的药物开发目前仍然未见突破［5］。而传统中医药理论注重整体理论，通过对多靶点的干预改善疾病的进程，因此中医药在治疗复杂疾病方面具有一定优势［16-17］。在药物开发中，网络药理学方法能够同时基于化学与生物信息对药物与机体的互相作用进行探讨［18］。网络药理学和中医药理论的整体观念具有共同点，能够系统地分析中药复方改善复杂疾病中人体功能网络失衡的作用机制［19］。近年来，中药复方已经越来越多地参与到结直肠癌的治疗中［8-11］。

在本研究中，我们基于网络药理学方法分析了四君子汤治疗结直肠癌的药理机制。评估节点的网络拓扑参数进而衡量其在网络中的重要性是常用的网络药理学研究手段［14］。通过建立四君子汤化合物-靶标网络并使用拓扑参数筛选方法进行网络优化，我们建立了四君子汤化合物-靶标核心网络。该网络包括7个化合物以及33个靶标，7个化合物分别为高丽槐素、罗通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇与人参皂苷rh2，其中山萘酚被报道能够抑制肺癌细胞的增殖与迁移［20］，常春藤皂苷元与豆甾醇能够诱导肿瘤细胞凋亡［21-22］。使用富集分析工具发现四君子汤治疗结直肠癌的潜在主要信号通路为PI3K-Akt 信号通路、雌激素信号通路、cGMP-PKG 信号通路及PPAR信号通路及VEGF信号通路等，其中PI3K-Akt信号通路与结直肠癌直接相关［23］，雌激素信号通路可以通过影响G 蛋白偶联雌激素受体增加结直肠癌的增殖［24］，cGMP-PKG 信号通路与结直肠癌患者生存相关［25］，PPAR 信号通路能够靶向FABP4 促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移［26］，VEGF 信号通路能够直接影响结直肠癌的耐药性［27］。该结果提示，在四君子汤中，7 种化合物可能通过影响以上信号通路对结直肠癌的治疗产生影响。

鲁棒性是指生物信息网络在受到内外干扰的情况下维持其网络稳定性的能力，鲁棒性越高表示网络越稳定［28］。在生物信息网络中，通过加入或敲除靶标引起的网络扰动已经被认为是探讨靶标重要性的关键。在网络药理学研究中，网络稳定性考察已经是一种常用的研究方法［15，29］。在本研究中，我们将7 种化合物的关联靶标在四君子汤化合物-靶标核心网络进行分别敲除，进而使用鲁棒性评估7 种化合物对四君子汤化合物-靶标核心网络的贡献大小。通过筛选，我们保留了高丽槐素、罗通定、山萘酚和常春藤皂苷元4 种化合物，提示这4 种化合物可能是四君子汤治疗结直肠癌的潜在有效化合物。通过建立4 种化合物的网络并与四君子汤治疗结直肠癌进行富集分析对比，我们发现4 种化合物与四君子汤治疗结直肠癌的信号通路在PI3K-Akt 信号通路、cGMP-PKG 信号通路及PPAR 信号通路上高度重合；同时，药物结合、质膜区响应与神经元影响等生物进程、分子功能与细胞组分也被四君子汤和4 种化合物靶标的共同富集，其中，药物结合被报道与结直肠癌中药物靶点直接相关［30］，肠神经元在结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用［31］，质膜区响应与结肠直肠腺瘤检测有关［32］。该结果提示PI3K-Akt 信号通路、cGMP-PKG 信号通路及PPAR 信号通路可能是四君子汤治疗结直肠癌的潜在作用机制；药物结合、质膜区响应与肠神经元影响可能是四君子汤治疗结直肠癌的潜在物质基础。

在癌症治疗中，化合物对信号通路以及物质基础的影响最终会影响生物功能及进程［33］。在网络药理学研究中，通过建立化合物-靶标作用网络可以进行化合物潜在作用机制的预测［34］。在本研究中，我们对四君子汤治疗结直肠癌的潜在信号传导途径进行了预测。PPAR 信号通路能够影响机体的脂代谢［35］与细胞生存［36］；PI3K-Akt 信号通路直接参与生物体内的脂代谢［37］、细胞生存［38］、细胞周期［39］及细胞凋亡［40］；cGMP-PKG 信号通路则与细胞的增殖以及凋亡密切相关［41］；同时，药物结合能够影响肿瘤细胞凋亡［42］，质膜区响应是细胞周期改变中的重要环节［43］，肠神经元改变通过影响细胞周期与凋亡进程促进结直肠癌的发生发展［31］。本研究中，我们预测中药复方四君子汤中的高丽槐素、罗通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能通过调控PI3K-Akt、cGMP-PKG与PPAR信号通路以及药物结合、质膜区响应与神经元影响等生物功能进而影响机体内的脂代谢、细胞生存、细胞周期和细胞凋亡进程，从而发挥对结直肠癌的治疗作用；其中，山萘酚并未影响cGMP-PKG 信号通路。该结果提示四君子汤以及其中的化合物高丽槐素、罗通定、山萘酚和常春藤皂苷元能够多靶点多通路地通过协同作用影响结直肠癌治疗；四君子汤治疗结直肠癌的潜在作用机制与调控PI3KAkt、cGMP-PKG 与PPAR 信号通路并影响下游生物功能密切相关。

在本研究中，通过网络药理学方法，我们预测四君子汤治疗结直肠癌的作用机制可能主要集中在7 种化合物与33 个靶标上；高丽槐素、罗通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能是四君子汤治疗结直肠癌的关键化合物；四君子汤治疗结直肠癌的潜在作用机制与调控PI3K-Akt、cGMP-PKG和PPAR信号通路以及药物结合、质膜区响应和肠神经元进而影响脂代谢、细胞生存、细胞周期与细胞凋亡有关。该研究能够为四君子汤改善结直肠癌的临床治疗及药物开发提供思路与物质基础。然而，四君子汤治疗结直肠癌的作用机制仍未彻底明晰。在未来的研究中，我们将使用体内外药理学验证的方法，对本研究中的网络药理学预测结果进行验证并考察4 种化合物在结直肠癌治疗中的协同作用。