丹参通络解毒汤对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子/成纤维细胞生长因子诱导14通路的影响

王中超，何延忠，赵栋梁，周 淼

(河南中医药大学第三附属医院肺病科，河南 郑州 450003)

肺纤维化是一种慢性肺部疾病，其特征是细胞外基质向间质过度沉积，造成肺功能进行性损害，最终导致呼吸衰竭[1]。研究发现,环境污染、细菌感染、吸烟、胃食管瘘以及博莱霉素等药物与肺纤维化的发病密切相关[2-3]。近年来，肺纤维化患者的病死率显著增加，严重威胁人类健康。目前，美国食品药品监督管理局批准将吡非尼酮和尼达尼布用于肺纤维化的治疗，然而，吡非尼酮和尼达尼布虽然有助于稳定患者的病情，但并不能逆转纤维化的进展，且存在一定不良反应，如胃肠道不适、皮疹光敏性等[4-5]。因此，有必要研究探索肺纤维化的新治疗方法。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是肿瘤坏死因子超家族的一员，参与机体免疫应答、炎症反应、细胞稳态、组织修复等；成纤维细胞生长因子诱导14(fibroblast growth factor-inducible14，Fn14)是TWEAK的主要受体，其通过激活下游信号通路发挥生物学功能；研究显示，TWEAK/Fn14信号通路可调控肾间质纤维化信号转导通路以及部分炎症相关通路，而TWEAK抑制剂起到了缓解肾间质纤维化进展的作用[6]；但目前关于TWEAK/Fn14信号通路在肺纤维化中的作用尚不清晰。丹参通络解毒汤是在《温病条辨》清营汤和《时方歌括》丹参饮基础上结合叶天士络病理论及临床实践而来的中药方剂[7]。药理研究证实，丹参通络解毒汤具有调节血脂代谢、抑制心肌纤维化、调节细胞黏附分子的作用[8]，但其在博莱霉素诱导的肺纤维化中的作用尚不明确,其是否可通过调控TWEAK/Fn14通路而改善肺纤维化尚不清楚。因此，本研究通过观察丹参通络解毒汤对肺纤维化小鼠体质量、肺系数、肺组织病理、炎症细胞因子、TWEAK/Fn14通路因子变化的影响，探讨丹参通络解毒汤对肺纤维化的作用效果及机制，旨在为肺纤维化的治疗提供潜在的方法及靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄无特定病原体级C57B/L小鼠50只，体质量20～24 g，购自成都达硕实验动物有限公司[许可证号：SYXK(川)2019-189]。所有小鼠在20～24 ℃、相对湿度45%～55%、12 h/12 h明暗光周期条件下，给予普通颗粒饲料饲养。

1.2 主要试剂与仪器丹参通络解毒汤(主要药物组成：丹参15 g、玄参15 g、当归10 g、黄连6 g、生地黄15 g、金银花10 g)由湖南君昊中药饮片科贸有限公司提供，浸泡，去渣，水煎浓缩至药液质量浓度4 g·mL-1(含生药)[药材投料量(g)/药液体积(mL)]，保存备用。1,25-二羟维生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3，纯度≥99%]购自美国Sigma公司，注射用盐酸博来霉素(国药准字H20055883)购自海正辉瑞制药有限公司，TWEAK/Fn14受体抑制剂PDL192购自美国MedChem Express公司，白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-4、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司,苏木精染液、伊红染液购自珠海贝索生物技术有限公司,过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)购自上海晶天生物科技有限公司， TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)购自北京宝日医生物技术有限公司，TNF-α、IL-1β、细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、TWEAK、Fn14、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、母亲信号蛋白同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3，Smad3)、磷酸化母亲信号蛋白同源物3(phospho rylated Smad3，p-Smad3)、信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、酪氨酸磷酸化STAT3(tyrosine phosphorylated STAT3，p-STAT3)一抗抗体均购自英国Abcam公司，细胞裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，化学发光法(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒购自美国Affinity公司；SpectraMAX Plus384酶标仪购自美国Molecular Devices公司，数码三目摄像显微镜购自厦门麦克奥迪实业集团有限公司，JY200C电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠分组及肺纤维化模型制备小鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组、模型组、1，25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组，每组10只。建模步骤[9]：各组小鼠均禁食12 h，次日晨经腹腔注射戊巴比妥钠2.5 g·L-1进行麻醉后，将小鼠仰卧固定于操作台上，用碘球消毒颈部及其周围皮肤，持消毒器械剥开小鼠颈部的皮肤，剥离肌肉组织暴露气管。除空白组外，其余各组小鼠均采用一次性注射器，于甲状软骨下2个环状软骨之间的气管软骨环间隙进针，有突破感后缓慢水平进针，回抽未见血液等异常液体后，缓慢注入博莱霉素(3.5 mg·kg-1，溶于 0.1 mL生理盐水)，迅速将小鼠保持直立，左右旋转各30 s，使博莱霉素溶液均匀分布于双肺。空白组小鼠采用一次性注射器于甲状软骨下2个环状软骨之间的气管软骨环间隙进针，注入0.1 mL生理盐水，并将小鼠保持直立，左右旋转各30 s。最后将各组小鼠的切口对齐缝合，并用无菌敷贴粘贴。待小鼠自然苏醒后，每组随机取2只小鼠处死，取肺组织，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色进行病理检查，小鼠肺组织支气管结构较为模糊、部分支气管上皮细胞坏死、间质周围炎症细胞浸润表明小鼠肺纤维化模型制备成功。

1.3.2 给药方法及标本采集造模成功后，空白组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水10 mL·kg-1；1，25(OH)2D3组小鼠每日经腹腔注射5 μg·kg-1的1，25(OH)2D3；丹参通络解毒汤组小鼠每日灌胃丹参通络解毒汤汤剂0.039 mL·g-1(按成人60 kg体质量计算，相当于生药15.65 g·kg-1)；丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠每日灌胃丹参通络解毒汤汤剂0.039 mL·g-1，并经腹腔注射PDL192 3 mg·kg-1；各组小鼠均每日给药1次，连续给药28 d。各组小鼠末次给药后12 h测体质量，然后经腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，将小鼠固定于操作台上，将其气管上段切开一T形小口，放进硅胶管，使用1 mL注射器通过气管插管将0.5 mL的生理盐水注入气管，回抽采集肺支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，灌洗3次，将收集的BALF合并备用。然后用手术剪打开实验鼠胸腔，分离气管后取出整个肺组织，测肺组织质量后分离左右肺组织，将左肺组织用40 g·L-1多聚甲醛固定，将右肺组织置于-80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续检测。

1.3.3 5组小鼠肺系数计算根据5组小鼠末次给药后12 h的体质量及肺组织质量计算小鼠肺系数，肺系数=肺湿质量(mg)/体质量(g)×100%。

1.3.4 5组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平检测取采集的BALF约1.5 mL，3 500 r·min-1离心10 min，收集上清液。设空白孔、标准品孔、待测样品孔，其中空白孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔加入配好的标准品50 μL，然后加入辣根过氧化物酶100 μL；待测样品孔加入样本50 μL，然后加入辣根过氧化物酶100 μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育60 min。揭膜，弃去液体，于每孔加满洗涤液后静置1 min，弃去液体，重复5次。每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。在15 min内，采用酶标仪于450 nm波长依序测量各孔的吸光度，通过标准曲线计算BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平。

1.3.5 5组小鼠肺组织病理学变化观察取多聚甲醛固定的各组小鼠左肺组织，石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯透明，梯度乙醇水化(体积分数50%乙醇2 h，体积分数70%乙醇1 h，体积分数85%乙醇 1 h，体积分数95%乙醇1 h，体积分数100%乙醇 1 h)，进行HE染色(苏木精染色10 min、伊红染色3 min、体积分数1%盐酸乙醇分化3 s)和Masson三色法染色(天青石蓝染色液滴染2～3 min，苏木精染色液滴染2～3 min，丽春红品红染色液滴染10 min，切片不水洗，直接滴入苯胺蓝染色液染5 min)，中性树脂封片后，采用数码三目摄像显微镜观察小鼠肺组织病理学变化。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测5组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA表达取-80 ℃保存的各组小鼠右肺组织100 g，加入1 mL RNA提取试剂，冰上匀浆 30 s，加入0.2 mL氯仿，充分震荡混合30 s，室温下15 000 r·min-1离心15 min，取上清液，在上清液中加入异丙醇，混合后，12 000 r·min-1离心10 min，获取总RNA。使用Takara TB Green PreMix Ex Taq定量检测基因表达水平，以β-actin为内参，TWEAK上游序列：5′-TCACCCGGGCTGGGCTCTAC-3′，下游序列：5′-CGAGGGAACTGGCCGCAGTG-3′；Fn14上游序列：5′-ACCTGGACAAGTGCATGGACTGC-3′，下游序列：5′-GCGTGAGGCTCCTTTCTGTT-3′；TGF-β1上游序列：5′-CCTTGCCCTCTACAACCAACAC-3′，下游序列：5′-CTTGCAGGAGCGCACGATC-3′；β-actin上游序列：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游序列：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。qRT-PCR反应条件：95 ℃初始变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s；45个循环；记录循环阈值(threshold cycle，CT)值，采用2-△△Ct法计算TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达水平。

1.3.7 Western blot法检测5组小鼠肺组织炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量取-80 ℃保存的各组小鼠右肺组织100 g，于匀浆器中剪碎，加入400 μL裂解液置于冰上匀浆，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，100 ℃煮10 min后置于-20 ℃冰箱保存，使用等量蛋白质上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转至聚偏二氟乙烯膜，脱脂牛奶封闭1 h，加入TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1一抗(稀释比例为1500)，4 ℃孵育过夜，然后滴加二抗稀释液(稀释比例为15 000)，室温孵育1 h，使用ECL暗室显色。以β-actin为内参，应用Image-Pro Plus6.0软件分析各条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.3.8 Western blot法检测5组小鼠肺组织TWEAK/Fn14通路因子TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量取-80 ℃保存的各组小鼠右肺组织100 g，于匀浆器中剪碎，加入400 μL裂解液置于冰上匀浆，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，取上清液。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，100 ℃煮10 min后置于-20 ℃冰箱保存，使用等量蛋白质上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转至聚偏二氟乙烯膜，脱脂牛奶封闭1 h，加入TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3一抗(稀释比例为1500)，4 ℃孵育过夜，然后滴加二抗稀释液(稀释比例为15 000)，室温孵育1 h，使用ECL暗室显色。以β-actin为内参，应用Image-Pro Plus6.0软件分析各条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 5组小鼠体质量、肺系数比较结果见表1。空白组、模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠肺系数显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤+PDL192组与空白组小鼠肺系数比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；1,25(OH)2D3组与模型组小鼠肺系数比较差异无统计学意义(P>0.05)。与1,25(OH)2D3组比较，丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤组与1,25(OH)2D3组小鼠肺系数比较差异无统计学意义(P>0.05)；丹参通络解毒汤+PDL192组与丹参通络解毒汤组小鼠肺系数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 5组小鼠体质量及肺系数比较

2.2 5组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平比较结果见表2。与空白组比较，模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平显著升高，丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠BALF中IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠BALF中TNF-α、IL-4水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与1,25(OH)2D3组比较，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与丹参通络解毒汤组比较，丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 5组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平比较

2.3 5组小鼠肺组织病理变化结果见图1。空白组小鼠肺组织结构正常，无结缔组织增生，无明显胶原沉积(图1A)。模型组小鼠肺组织基本形态结构被破坏，支气管结构较为模糊，部分支气管上皮细胞坏死，间质周围炎症细胞浸润，肺组织有大量胶原沉积(蓝色)(图1B)。1,25(OH)2D3组小鼠肺组织基本形态结构被破坏，上皮细胞坏死，坏死区域肺泡腔较为狭窄，内含大量细胞碎片和炎症细胞，部分区域可见成纤维细胞增生，胶原沉积明显减少(图1C)。丹参通络解毒汤组小鼠部分区域肺组织结构被破坏，支气管结构较为完整清晰，部分肺泡结构模糊，肺泡腔狭窄，间质及周围未见水肿或炎症细胞浸润，胶原沉积明显减少(图1D)。丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织结构较为正常，各级支气管结构完整清晰，肺泡结构较为清晰，肺泡腔内可见少量炎症细胞散在分布，间质及周围未见水肿或炎症细胞浸润，胶原沉积明显减少(图1E)。

A：空白组；B：模型组；C：1,25(OH)2D3组；D：丹参通络解毒汤组；E：丹参通络解毒汤+PDL192组。

2.4 5组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量比较结果见表3。与空白组比较，模型组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量及1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TWEAK mRNA相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，丹参通络解毒汤组小鼠肺组织中Fn14 mRNA相对表达量及丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相对表达量与丹参通络解毒汤组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 5组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1 mRNA相对表达量比较

2.5 5组小鼠肺组织中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量比较结果见表4和图2。与空白组比较，模型组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量及1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠肺组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量及丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与1,25(OH)2D3组比较，丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中IL-1β蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与丹参通络解毒汤组比较，丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织中IL-1β蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2组小鼠肺组织中TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 5组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相对表达量比较

1：空白组；2：模型组；3：1,25(OH)2D3组；4：丹参通络解毒汤组；5：丹参通络解毒汤+PDL192组。

2.6 5组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量比较结果见表5和图3。与空白组比较，模型组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组与空白组小鼠肺组织中Smad3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TWEAK、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中Fn14、Smad3蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、α-SMA、p-Smad3、STAT3蛋白相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织中Fn14、TGF-β1、Smad3、p-STAT3蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中p-Smad3蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、STAT3、Smad3、p-STAT3蛋白相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中Smad3、p-STAT3蛋白相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织中Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、p-STAT3蛋白相对表达量及丹参通络解毒汤小鼠肺组织中TWEAK、STAT3蛋白相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义(P>0.05)；丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织中TWEAK、STAT3蛋白相对表达量显著低于1,25(OH)2D3组，差异有统计学意义(P<0.05)。丹参通络解毒汤+ PDL192组与丹参通络解毒汤组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、p-STAT3、STAT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 5组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量比较

1：空白组；2：模型组；3：1,25(OH)2D3治疗组；4：丹参通络解毒汤组；5：丹参通络解毒汤+PDL192组。

3 讨论

肺纤维化是一种慢性、不可逆的致命性疾病，其病死率超过了许多癌症，但肺纤维化的治疗选择有限。随着环境恶化等因素的影响，肺纤维化的发病率在全球呈上升趋势，已成为严峻的健康问题[10]。尽管吡非尼酮、尼达尼布治疗对肺纤维化有较好的效果，但其不可避免地会导致胃肠道不适、皮疹光敏性等不良反应，从而限制了其临床应用。丹参通络解毒汤具有调节血脂代谢、抑制心肌纤维化、调节细胞黏附分子的作用，但其治疗肺纤维化的疗效及机制尚不明确。因此，探讨丹参通络解毒汤治疗肺纤维化的效果及作用机制，对于丹参通络解毒汤的临床应用及开发肺纤维化的有效治疗靶点、提高患者的生存率具有重要意义。

博莱霉素诱导的动物肺纤维化模型被广泛用于研究肺纤维化的发病机制和评价新的治疗策略[11]，因此，本研究采用了博莱霉素诱导制备小鼠肺纤维化模型。1,25(OH)2D3是最具活性的维生素D形式，其具有调节钙磷代谢、激素分泌、免疫反应、细胞分化和凋亡等生物学功能，且与间质性肺疾病严重程度具有相关性，研究发现1,25(OH)2D3可以改善实验性肺纤维化[12-13]。因此，本研究采用1,25(OH)2D3干预作为阳性对照。PDL192是TWEAK受体抑制剂，起到抑制TWEAK/Fn14通路的作用，本研究设置丹参通络解毒汤+ PDL192组，旨在观察丹参通络解毒汤对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的影响是否是通过TWEAK/Fn14通路而发挥作用。

本研究首先从小鼠体质量、肺系数及肺组织病理角度进行观察，结果显示，博莱霉素引起了小鼠明显的肺损伤，表现为注射博莱霉素后小鼠肺系数升高，而体质量呈下降趋势，小鼠肺组织基本形态结构被破坏，支气管结构较为模糊，部分支气管上皮细胞坏死，间质周围炎症细胞浸润，表明小鼠模型诱导成功。本研究结果显示，模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠的肺系数与空白组比较显著增高，提示小鼠肺组织受损，发生了肺水肿；丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数与空白组比较差异无统计学意义，说明丹参通络解毒汤+PDL192对控制小鼠肺水肿有良好效果；1,25(OH)2D3组小鼠肺系数与模型组比较差异无统计学意义，丹参通络解毒汤组小鼠肺系数与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义，丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数与丹参通络解毒汤组比较差异无统计学意义，但模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数呈下降趋势，其中丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数与模型组比较显著降低，丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺系数与1,25(OH)2D3组比较显著降低，说明丹参通络解毒汤控制肺水肿的效果与1,25(OH)2D3组相当，而丹参通络解毒汤+PDL192控制肺水肿的效果优于1,25(OH)2D3组。同时，病理组织学观察显示，模型组小鼠肺组织基本形态结构破坏严重，肺组织有大量的胶原沉积；1,25(OH)2D3组小鼠肺组织基本形态结构被破坏，上皮细胞坏死，坏死区域肺泡腔较为狭窄，内含大量细胞碎片和炎症细胞，部分区域可见成纤维细胞增生，胶原沉积明显减少；丹参通络解毒汤组小鼠部分区域肺组织结构被破坏，支气管结构较为完整清晰，部分肺泡结构模糊，肺泡腔狭窄，间质及周围未见水肿或炎症细胞浸润，胶原沉积明显减少；丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织结构较为正常，各级支气管结构完整清晰，肺泡结构较为清晰，肺泡腔内可见少量炎症细胞散在分布，间质及周围未见水肿或炎症细胞浸润，胶原沉积明显减少；提示1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192对小鼠肺组织损伤均有改善作用，其中丹参通络解毒汤+PDL192的改善效果更佳。

炎症反应是肺纤维化的重要诱因，在博莱霉素诱导的肺纤维化中，炎症细胞主要包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞[14]。巨噬细胞会分泌趋化因子，募集炎症细胞和促纤维化细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-4，从而形成纤维化的微环境[15]。ICAM-1和其受体淋巴细胞功能相关抗原1的相互作用可导致炎症细胞黏附于血管内皮细胞并浸润到支气管，ICAM-1的高表达影响炎症细胞与血管内皮细胞的黏附，并可介导炎症细胞的内皮转移，且ICAM-1的高表达有助于肺泡腔内活化的T细胞和多核白细胞的连接，从而刺激肺泡上皮细胞的炎症反应[16-17]。ICAM-1与TGF-β和结缔组织生长因子在肺纤维化早期发挥协同作用，参与肺组织炎症反应和肺纤维化的修复[18]。VCAM-1是甚晚抗原4的内皮配体，表达于活化的血管内皮细胞，可介导炎症细胞黏附并促进其向内皮下迁移，是重要的炎症募集分子[19]。博莱霉素可导致VCAM-1过表达，进而促进炎症细胞向内皮下浸润，发挥炎症募集作用，抑制VCAM-1信号的转导能够减轻炎症反应[20]。此外，VCAM-1还在白细胞的跨内皮细胞迁移中发挥作用[21]。博莱霉素促进肺微血管内皮细胞VCAM-1的表达和中性粒细胞的黏附[22]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平显著升高，提示模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组小鼠肺组织发生炎症反应；1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平与模型组比较显著降低，提示1,25(OH)2D3、丹参通络解毒汤、丹参通络解毒汤+PDL192均对控制小鼠肺组织炎症反应具有一定效果；丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平与1,25(OH)2D3组比较显著降低，而TNF-α水平比较差异无统计学意义，提示丹参通络解毒汤、丹参通络解毒汤+PDL192 干预控制小鼠肺组织炎症反应的效果优于1,25(OH)2D3组。丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平与丹参通络解毒汤组比较显著降低，而TNF-α水平比较差异无统计学意义，且丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠BALF中TNF-α、IL-4水平与空白组比较差异无统计学意义，提示丹参通络解毒汤+PDL192控制炎症反应的效果优于单独使用丹参通络解毒汤。

研究认为，肺纤维化的主要病理特征为细胞外基质沉积；肺损伤后，在炎症细胞因子的刺激下，成纤维细胞向肌成纤维细胞转移，产生大量的细胞外基质[23]。α-SMA作为血管平滑肌细胞的主要成分，是肌成纤维细胞活化的特异性标志蛋白，是肺纤维化的主要生物标志物，可作为肺纤维化的指标[24]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织α-SMA蛋白相对表达量显著增高，提示模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠可能发生肺纤维化。丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织α-SMA蛋白相对表达量较模型组显著降低，说明丹参通络解毒汤、丹参通络解毒汤+PDL192具有抑制小鼠肺纤维化的作用；但丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织α-SMA蛋白相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义，丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织α-SMA蛋白相对表达量与丹参通络解毒汤组比较差异无统计学意义,提示丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192抑制小鼠肺纤维化效果与1,25(OH)2D3相当。

TGF-β1与其受体Ⅱ结合时，TGF-β受体Ⅰ激酶被激活，磷酸化Smad2和Smad3形成Smad4复合物，然后复合物被转移到细胞核，进而参与纤维化的发生、发展以及胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的沉积[25]。本研究显示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织TGF-β1mRNA及蛋白相对表达量显著升高，1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TGF-β1蛋白相对表达量显著升高，提示模型组、1,25(OH)2D3组小鼠TGF-β1高表达与肺纤维化有关。与模型组比较，丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织TGF-β1mRNA相对表达量显著降低，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织中TGF-β1蛋白相对表达量显著降低，提示丹参通络解毒汤、丹参通络解毒汤+PDL192干预可能通过抑制TGF-β1表达进而抑制肺纤维化进展。丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织TGF-β1mRNA及蛋白相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义，说明丹参通络解毒汤及丹参通络解毒汤+PDL192抑制肺纤维化的效果与 1,25(OH)2D3组相似。

TWEAK可以诱导酪氨酸705位点的STAT3磷酸化和核易位，并促进炎症细胞因子的分泌，而Fn14是TWEAK的主要受体，当TWEAK与Fn14耦合时，可使游离的Fn14活化，激活下游多条信号通路(包括Smad通路)而发挥生物学作用[26]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织TWEAK、Fn14 mRNA相对表达量及1,25(OH)2D3组小鼠肺组织TWEAK mRNA相对表达量显著升高；模型组小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量显著升高，1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中TWEAK、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量显著升高，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织TWEAK、p-Smad3、STAT3蛋白相对表达量显著升高，说明模型组、1,25(OH)2D3组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠TWEAK/Fn14通路相关因子表达有变化。与模型组比较，丹参通络解毒汤组Fn14 mRNA相对表达量及丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织TWEAK、Fn14 mRNA表达显著降低，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织TWEAK、Fn14 mRNA相对表达量与1,25(OH)2D3组比较差异无统计学意义，提示丹参通络解毒汤+PDL192组抑制TWEAK、Fn14 mRNA相对表达量的效果与1,25(OH)2D3组相似。1,25(OH)2D3组小鼠肺组织中p-Smad3蛋白相对表达量较模型组显著降低，丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+PDL192组小鼠肺组织TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3蛋白相对表达量显著降低，说明1,25(OH)2D3干预可抑制小鼠肺组织中p-Smad3蛋白表达，丹参通络解毒汤、丹参通络解毒汤+PDL192干预可抑制小鼠肺组织中TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3蛋白表达；与1,25(OH)2D3组比较，丹参通络解毒汤组小鼠肺组织TWEAK、Fn14Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义，提示丹参通络解毒汤与1,25(OH)2D3组干预效果相当。丹参通络解毒汤+ PDL192组小鼠肺组织TWEAK、STAT3蛋白相对表达量较1,25(OH)2D3组显著降低，说明丹参通络解毒汤+ PDL192较1,25(OH)2D3更显著抑制TWEAK、STAT3蛋白表达。此外，研究报道TWEAK和TGF-β1可诱导STAT3通路激活气道平滑肌细胞，在调节气道重塑过程中促炎症细胞因子的分泌中起重要作用[27]；通过siRNA沉默TWEAK，促进了STAT3磷酸化的抑制[28]。因此，提示丹参通络解毒汤可能通过TWEAK/Fn14途径调节肺纤维化过程中STAT3的活化，减轻博莱霉素对肺纤维化的影响。

综上所述，丹参通络解毒汤能够减轻博莱霉素诱导的肺纤维化，其机制可能与抑制肺部炎症和抑制TWEAK/Fn14信号通路有关。丹参通络解毒汤可能是治疗肺纤维化的一种有价值的药物。