蛇菰多糖降低实验性肝损伤大鼠肝脏BDNF和TrkB的表达

谢 雅，陈 颖，夏德尧，唐鲜娥，王凤杰，3，陈显兵*

(1.湖北民族大学附属民大医院 病理科, 湖北 恩施 445000; 湖北民族大学 2.医学部; 3.科技学院, 湖北 恩施 445000)

肝损伤是各种因素导致的肝细胞损伤，从而影响肝脏的正常功能。近年来肝损伤已成为严重威胁人类身体健康的疾病之一，目前针对中药治疗肝损伤的研究越来越受到重视。筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHook. f.BIH)，别名红菌、葛菌，是蛇菰科(Balanophoraceae)蛇菰属植物，是土家族“四大名药”之一，含有多糖和黄酮类等成分，具有清除自由基、降血压、抗肿瘤、止血和降血脂的作用，能提高人体免疫功能[1-3]，但蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)对实验性肝损伤的研究鲜有报道。本研究采用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立药物性肝损伤模型[4]，通过检测脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tryrosine kinase receptor B,TrkB)和凋亡相关蛋白及肝功能的变化，探讨对D-gal致大鼠肝损伤的保护作用机制，为蛇菰多糖(BPS)的药理作用和临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：半乳糖(D-galactose，D-gal)(Sigma-Aldrich 公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismu-tase,SOD)试剂盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；测脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor，TrkB)、B细胞淋巴瘤蛋白 2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)抗体(Abcam 公司)。蛇菰多糖(BPS)为本实验室自制筒鞘蛇菰的多糖提取物。该筒鞘蛇菰全株于2018年夏季采自湖北省恩施市望城坡，经湖北民族大学药用植物分类与鉴定实验室鉴定为蛇菰科蛇菰属植物。筒鞘蛇菰经捣碎、水浸、加热提取、过滤、醇沉、烘干等步骤得蛇菰粗多糖；再经Sevage法脱蛋白、水溶、氯仿-正丁醇分离上清、透析、冻干等步骤得BPS(相对分子质量为1 ku；级别为RC膜S/P6)。苯酚-硫酸法测定BPS多糖含量为61.3%。

1.1.2 大鼠：SPF级雄性SD大鼠50只，体质量(220±20)g，湖北省动物实验中心[许可证号SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

1.2.1 动物模型与分组：将大鼠随机分为对照组(control)；D-gal组(model，皮下注射D-半乳糖200 mg/kg，等剂量蒸馏水灌胃)；BPS低(D-gal+BPS-L)、中(D-gal+BPS-M)、高(D-gal+BPS-H)剂量组(50、100和200 mg/kg BPS灌胃干预)。实验动物正常进食和饮水，分笼伺养，自然光照周期，维持室温24 ℃，湿度56%左右，共6周。实验动物操作均符合动物伦理委员会制定的实验动物操作标准，接受湖北民族大学动物伦理委员会的监督与检查。

1.2.2 肝功能检测：大鼠禁食12 h，腹腔注射10%的水合氯醛，取心脏血液，静置2 h后离心取上清，采用全自动生化分析仪进行肝功能检测。

1.2.3 检测SOD活性和MDA含量：取肝组织约5 g，匀浆，离心后取上清液。取血清。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 肝脏HE染色：选取大鼠同一部位的肝组织，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片(片厚4 μm)，苏木素伊红染色，镜下观察。

1.2.5 免疫组化检测BDNF、TrkB：取肝组织石蜡切片，脱蜡至水，抗原修复后，用双氧水、血清封闭抗原，加入BDNF、TrkB一抗，浓度1∶500，4 ℃冰箱过夜，加入二抗，DAB显色，镜下观察。

1.2.6 Western blot检测BDNF、TrkB、Bcl-2、caspase-3和Bax蛋白：6周后，取肝脏组织加入裂解剂及蛋白磷酸酶抑制剂，冰上匀浆，离心，抽取上清，BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温封闭，加Bcl-2、caspase-3、Bax、BDNF、TrkB一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次3 min，加二抗，室温孵育2 h后TBST洗膜，ECL发光检测，LAS4000mini凝胶成象系统显影并分析，β-actin为内参。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

与对照组相比，D-gal组大鼠活动明显减少，毛发粗糙不顺，甚至有脱毛现象，进食减少。BPS干预后，上述状态均有明显改善，体质量也相对增加。

2.2 BPS对肝损伤大鼠谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的影响

与对照组相比，D-gal组ALT和AST水平升高(P<0.05)；与D-gal组相比，BPS各剂量组ALT、AST水平回降(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清中ALT和AST水平

2.3 BPS对肝损伤大鼠肝脏组织形态的影响

D-gal组大鼠的肝脏颜色变黄，体积增大，BPS不同剂量组的大鼠肝脏较D-gal组均有所改善。显微镜下，D-gal组肝细胞脂肪变性，少许淋巴细胞浸润。BPS低、中、高剂量组的肝小叶结构完整，细胞排列整；中、高剂量组细胞水肿比低剂量组明显减轻(图1)。

2.4 BPS对大鼠肝组织中BDNF、TrkB定位表达的影响

D-gal组大鼠肝组织中BDNF、TrkB呈黄色或棕黄色颗粒，分布在胞浆内。与D-gal组相比，BPS各剂量组大鼠肝组织中BDNF和TrkB阳性表达强度降低，呈淡黄色细颗粒状(图2)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg图1 各组大鼠肝组织HE染色结果Fig 1 Changes of liver tissues in each group by HE staining (×200)

2.5 BPS对大鼠血清中SOD和MDA水平的影响

与对照组相比，D-gal组SOD 活性降低(P<0.05)、MDA含量增加(P<0.05)；与D-gal相比，BPS各剂量组SOD 活性增加、MDA含量降低(P<0.05)(图3)。

2.6 BPS对大鼠肝组织中Bcl-2、caspase-3和Bax表达的影响

与对照组相比，D-gal组大鼠肝组织中Bcl-2表达量显著下降，Bax、caspase-3的表达量显著上升(P<0.05)，与D-gal组相比，BPS低、中、高剂量组Bcl-2、Bax和caspase-3的表达明显改善(P<0.05)(图4)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg图2 BDNF在各组大鼠肝组织中的表达Fig 2 Expression of BDNF in liver tissue of rats in each group(×200)

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg图3 TrkB在各组大鼠肝组织中的表达Fig 3 Expression of TrkB in liver tissue of rats in each group(×200)

2.7 BPS对大鼠肝组织中 BDNF和TrkB的影响

Western blot结果显示BDNF、TrkB在正常对照肝组织中表达较弱；D-gal组肝组织中BDNF、TrkB蛋白的表达明显上调(P<0.05)；BPS低、中、高剂量组BDNF、TrkB的表达与D-gal组相比明显降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

D-半乳糖作为磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂可引起肝损伤，被广泛应用于肝损伤模型的制备[5]。D-gal通过抑制肝细胞内蛋白质和mRNA的合成导致肝细胞凋亡、坏死和炎性细胞浸润[6]。ALT、AST是检测肝功能的重要指标，ALT、 AST的升高情况可反应肝细胞的损伤程度[7]。本研究结果显示，D-gal组大鼠体内ALT、AST表达水平明显升高；蛇菰多糖干预后大鼠体内ALT、AST表达水平明显降低，提示蛇多糖能明显改善D-gal引起的肝损伤。

表1 大鼠血清中SOD和MDA的水平Table 1 SOD and MDA levels in rat

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

SOD是抑制自由基形成的主要抗氧化酶， MDA组大鼠体内ALT、AST表达水平明显升高；蛇菰多糖干预后大鼠体内ALT、AST表达水平明显降低，提示蛇菰多糖能明显改善D-gal引起的肝损伤。MDA是脂质过氧化物的代谢产物，SOD活性降低，MDA水平升高会导致肝细胞损伤诱导肝细胞凋亡[8-9]。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，Bcl-2为凋亡抑制蛋白。Bcl-2水平升高可抑制Bax的作用，阻断细胞色素c释放，从而抑制caspase-3的活性，抑制细胞凋亡[10]。本实究结果表明，D-gal组中SOD活性明显降低，MDA的含量明显增加，BPS干预后SOD活性增加，MDA的含量降低，同时Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白的表达发生了相应的改变。提示BPS具有提高机体抗氧化能力和抑制肝细胞凋亡的作用。

BDNF是重要的营养因子，可特异性结合其受体TrkB，使其磷酸化并激活细胞内的酪氨酸激酶信号通路[11]，发挥生物学效应。研究发现，BDNF和TrkB不仅存在于海马等组织中，还存在于多种受损的组织中，肝组织中BDNF表达的增加可能导致肝病的高发病率[12]。本研究中，BDNF和TrkB在正常肝组织中无表达，D-gal损伤后表达明显增加，BPS干预后表达降低，提示BPS对肝脏的保护作用与BDNF、TrkB的表达降低有一定联系。

综上所述，BPS可以提高D-gal诱导的肝损伤后细胞的肝脏的抗氧化能力，表现为肝细胞内SOD活性升高，MDA含量降低；同时可提高肝组织中Bcl-2的表达、从而抑制Bax和caspase-3的表达水平，达到抑制肝细胞凋亡的作用；BPS还可改善D-gal诱导的肝损伤后细胞中BDNF和TrkB的表达，从而发挥肝脏保护作用。BPS是筒鞘蛇菰(BIH)的提取物，其护肝作用机制尚不清楚，因此深入研究其作用机制对开发中药治疗肝损伤具有重要的理论意义和实用价值。