小建中汤治疗抑郁症作用机制的网络药理学研究*

贾 暖，赵佳锋，钱万桥，张柳燕，郭 顺

（南方科技大学医院，广东 深圳 518055）

抑郁症以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。严重困扰患者的生活，影响其正常的社会功能［1］。据世界卫生组织统计，2015年全球抑郁症患病人数已达3.22亿，中国的抑郁症患病率约为4.2%［2］；2019年，中国精神卫生调查研究报告显示，我国抑郁症患者的终身患病率为6.8%，12个月患病率为3.6%［3］；2017年，世界卫生组织有关全球疾病负担的统计显示，抑郁障碍的伤残损失寿命年排第三位［4］。抑郁症不仅损害患者的健康，而且给家庭和社会造成极大负担。目前，西医治疗抑郁症存在许多不足，中药及其复方制剂治疗效果好，副作用少，依从性高［5］。小建中汤和舒肝解郁胶囊治疗焦虑症的有效率分别为97%和90.9%［6］。小建中汤治疗老年抑郁症2周、4周后，缓解抑郁情绪的有效例数分别为7/12例、10/12例［7］。小建中汤是《伤寒论》经方，由饴糖、桂枝、芍药、甘草、大枣、生姜组方，为温养中焦之剂，温中补虚，和里缓急，主治中焦虚寒、肝脾不和证，但其治疗郁证的研究相对较少［8］。2007年，英国邓迪大学Hopkins教授在网络生物学的基础上提出网络药理学［9］，通过构建药物-靶点-基因-疾病的相互作用网络，运用专业的可视化网络分析软件及算法，对现有数据库信息进行虚拟筛选和网络预测，探讨药物的作用机制［10］。由于其复杂性、整体概念及中医理论的辨证论治，中药作用机制的研究较困难。网络药理学研究理念恰好与中药多组分、多靶点、协同调节的作用模式契合，具有整体性、系统性的特点［11］。本研究中采用网络药理学探讨了小建中汤抗抑郁的作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 潜在活性成分及靶点筛选

通过检索TCMSP数据库（http://tcmspw.com/index.php）得到饴糖、桂枝、芍药、甘草、大枣、生姜的所有化合物成分，设定口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18、血脑屏障（BBB）≥-0.3为筛选条件，筛选出潜在的活性成分。再检索PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），得到活性成分的2D结构，最后在Swiss TargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）预测靶点，同时运用Cytoscape 3.8.0软件构建主要潜在活性成分-靶点网络。

1.2 抑郁症靶点获取

通过检索GeneCard数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（http://www.omim.org/）、DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org），得到与抑郁症相关的所有靶点基因，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），校对得到靶点基因名，选择生物物种为homo sapiens（human）。选择3个数据库中2个数据库及以上共有的靶点作为疾病候选靶点。

1.3 蛋白互作网络（PPI）构建

将药物的靶点蛋白和疾病候选靶点蛋白分别导入String数据库（https://string-db.org/），物种设为“Homo sapiens”，阈值设为中等置信度“mediumconfidence=0.4”，其余参数保持默认设置不变，获取2个蛋白相互作用的PPI。结果以.tsv格式保存，并导入Cytoscape 3.8.0软件，通过“Merge”功能得到2个PPI的交集网络，再利用“Network Analysis”功能分析网络的拓扑属性，依据其节点度值的网络拓扑参数，明确核心靶点蛋白。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

使用Metascape在线分析工具（http://metascape.org）对网络合并后获得的核心靶点蛋白分别进行GO富集分析和KEGG通路分析。采用统计学超几何分布定量（P）＜0.01评估存在于各GO注释中的蛋白质群，以P值反映蛋白质生物学功能的显著性，选择生物过程、分子功能、细胞组分3个模块。通过KEGG通路分析的功能条目，考察中药的潜在靶标可能具有的生物学功能及参与的生物学通路，进而得到小建中汤治疗抑郁症的主要作用通路。

2 结果

2.1 小建中汤潜在活性成分及靶点获取

共得到90个潜在活性成分，桂枝3个，甘草69个，大枣18个，白芍3个，生姜5个，其中有4个成分是2个以上药物的共有成分。TCMSP数据库无法检索到饴糖，由于饴糖在小建中汤中含量较高，结合TCMID数据库（http://www.megabionet.org/tcmid/）和文献［12-13］，保留其麦芽糖这一主要活性成分。去掉Swiss TargetPrediction数据库预测到的靶点可能性小于0.1及无法预测到靶点的成分，增加肉桂醛、芍药苷、牡丹酚、没食子酸4个可能对抑郁症有作用的成分［14-16］。最终得到68个成分，其中潜在活性成分桂枝4个，甘草51个，大枣9个，白芍6个，生姜5个，饴糖1个。在Swiss TargetPrediction数据库中检索潜在活性成分，获得144个靶点，同时运用Cytoscape 3.8.0软件构建药物-潜在活性成分-靶点网络，得到6个药物，68个药物成分，144个靶点基因。节点的度值越大，节点大小越大，颜色越深。详见图1。

图1 药物-药物成分-靶点基因网络Fig.1 Herbs-active ingredient-target gene network

2.2 抑郁症靶点获取、PPI构建及核心网络提取

通过检索GeneCard，OMIM，DisGeNET 3个数据库，并经Uniprot数据库校对，得到2个及以上数据库共有的疾病靶点，共1 844个疾病基因。药物靶点基因与疾病靶点基因分别做PPI后，去掉游离节点，得到药物靶点基因的PPI共132个节点，909条边；疾病靶点基因的PPI共1 735个节点，45 251条边。2个网络交集得到67个节点、434条边的PPI网络，通过设置度值＞12（度值的中位数），筛选得36个节点、280条边的PPI，得到核心靶点基因36个。详见图2。其对应的核心活性成分36个（见表1）。根据度值测算出小建中汤治疗抑郁症的前10个重要靶标，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、单胺氧化酶A（MAO-A）、单胺氧化酶B（MAO-B）、海马神经元中淀粉样前体蛋白（APP）、乙酰胆碱酯酶（AChE），以 及CNR1，CHRNA4，SLC6A4，DRD2，SLC6A3。

表1 小建中汤治疗抑郁症的核心活性成分Tab.1 Core active ingredients of Xiaojianzhong Decoction in the treatment of depression

图2 核心靶点基因网络提取过程Fig.2 Extraction process of core target gene network

2.3 核心靶点基因GO富集分析及KEGG通路分析

使用Metascape在线分析工具对小建中汤治疗抑郁症的36个核心候选靶点进行GO富集分析，生物过程共富集到630条，主要涉及化学突触传递、G蛋白耦联受体信号通路、与环状核苷酸第二信使耦联、神经递质水平的调节、化学突触传递的调节等，详见图3。分子功能共富集到61条，主要涉及G蛋白耦联的胺受体活性、神经递质受体活性、儿茶酚胺结合、肾上腺素受体活性、多巴胺结合、血清素受体活性等，详见图4。细胞组分共富集到46条，主要涉及突触前膜、突触后膜、树突、膜筏等，详见图5。使用Metascape在线分析工具对小建中汤治疗抑郁症的36个核心候选靶点进行KEGG生物途径富集分析，共富集到31条。结果显示，其机制主要涉及神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触、环磷酸腺苷（cAMP）、可卡因成瘾、间隙连接、调节脂肪细胞中的脂肪分解、苯丙胺成瘾、环磷酸鸟苷酸（cGMP）-环磷酸鸟苷酸依赖的蛋白激酶（PKG）、内分泌抵抗、雌激素信号通路、Rap1、胆碱能突触、肾素分泌等信号通路，详见图6。

图3 生物过程GO富集气泡图Fig.3 Bubble chart of GO enrichment for biological process

图4 分子功能GO富集气泡图Fig.4 Bubble chart of GO enrichment for molecular function

图5 细胞组分GO富集气泡图Fig.5 Bubble chart of GO enrichment for cell components

图6 KEGG通路富集气泡图Fig.6 Bubble chart of KEGG pathway

2.4 小建中汤核心成分-核心靶点-通路构建

使用Cytoscape 3.8.0软件对前20条通路及其对应靶点和化合物进行分析，构建小建中汤治疗抑郁症对应核心成分-核心靶点-通路网络示意图，得到31个核心靶点，20条信号通路，31个核心成分。节点的度值越大，节点大小越大，颜色越深，详见图7。可见，荷叶碱（nuciferin）、可可碱［（S）-coclaurine］、左旋千金藤啶碱（stepholidine）等为小建中汤的有效成分，雌激素受体1（ESR1）及AKT1，AchE，MAO-B等为作用靶点，神经活性配体-受体相互作用通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羟色胺能突触（serotonergic synapse）、钙信号通路（calcium signaling pathway）等为信号通路。

图7 核心成分-核心靶点-通路网络Fig.7 Core ingredients-core targets-pathway network

3 讨论

本研究中，通过预测靶点基因、构建PPI及提取核心网络，共筛选出AKT1，SLC6A4，APP，DRD2，MAO-A，CHRNA4，MAO-B，SLC6A3，AchE，CNR1等36个核心靶点。Akt1为磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）下游的关键靶点之一，重度抑郁症自杀患者的脑组织中Akt蛋白活性明显降低［17］。研究发现，Akt1的多态性与抑郁症患者的抑郁严重程度显著相关，与抑郁症患者的焦虑症状、工作、活动、自杀倾向密切相关［18］。SLC6A3和SLC6A4分别为多巴胺和5-羟色胺（5-HT）的转运蛋白，在调节对这些神经递质的神经元反应中起重要作用［19］。研究发现，抗抑郁药物通过停留在跨膜螺旋1，3，6，8，10间的中央结合位点而将SLC6A4锁定为向外开放的构型，直接阻断5-HT的结合［20］。SLC6A3敲除小鼠的抑郁症动物模型实验结果显示，多巴胺转运蛋白的活性对抑郁症有显著影响［21］。APP的过度表达导致β-淀粉样肽的产生增加，进而抑制兴奋性传递［22］。DRD2是多巴胺系统中的一个重要受体，是目前使用的多数抗精神病药物的靶标［23］。有研究发现，大鼠脑深部内侧前脑束刺激后表现出抗抑郁样反应，同时DRD2表达增加［24］。MAO-A和MAO-B与抑郁症密切相关，在单胺类神经递质代谢中起关键作用，均为抗抑郁药物单胺氧化酶抑制剂的药理学作用靶点［25-26］。已有研究证明，β-细辛醚可减少小鼠脑内AChE的表达水平，且增加小鼠脑内的多巴胺表达水平，进而发挥抗抑郁作用［27］。CNR1与抑郁症密切相关，其激动剂具有抗抑郁样性质，并通过前额叶内侧皮层调节5-HT的神经元活性［28］。

KEGG通路富集分析结果表明，小建中汤治疗抑郁症主要的通路为神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、钙信号通路、多巴胺能突触、cGMP-PKG信号通路等。其中，神经活性配体-受体相互作用信号通路涉及细胞质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体［29］。该通路涉及了血清素受体、多巴胺受体、肾上腺素受体等20个靶点。而该通路与抗精神病药理学有关，这对于制订改善精神分裂症的治疗策略至关重要［30］。研究表明，抑郁症与5-HT受体及其功能有较大联系，且5-HT1A，5-HT1B，5-HT1D，5-HT2A，5-HT2C，5-HT7等受体与抑郁症关系密切［31］。快感缺乏症被认为是抑郁症的核心特征，而多巴胺系统在这种抑郁症所描述的欣快感缺失中起着关键作用［32］。研究发现，抑郁症与二价钙离子的失调有关，其主要通过钙信号传导级联发挥作用［33］。钙信号通路刺激一氧化氮（NO）合成，进而诱导鸟苷酸环化酶将三磷酸鸟苷转化为cGMP。另有研究表明，小檗碱通过NO-cGMPPKG细胞信号转导通路发挥抗抑郁作用［34］。

综上所述，小建中汤治疗抑郁症具有多靶点、多途径、多通路的特点，多巴胺受体、转运蛋白、AchE和MAO为小建中汤抗抑郁的主要候选靶点，其可能通过神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、多巴胺能突触、钙信号等通路发挥作用。