基于网络药理学与分子对接技术的参虎半夏汤抗胃癌机制研究

任 娟，康 妍，马纯政，陈伟霞，牛垚飞

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450000；2.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南 郑州 450000；3.河南省人民医院，河南 郑州 450003)

据2020年全球肿瘤最新统计数据，全世界估计有1 930万新发癌症病例和1 000万死亡病例，其中胃癌新发病例占5.6%、死亡病例占7.7%，其发病率位于第5位、死亡率第4位[1].近年来胃癌诊断和治疗方法的进步使发病率和死亡率总体下降，但由于高度时空异质性，复发率较高，预后仍然很差.近年来，中医药防治胃癌收到较好疗效，中医认为胃癌发生的根本病机为“正气亏虚，邪毒内结”.基于益气解毒理论，课题组团队带头人马纯政主任医师结合科室多年临床经验，创立参虎半夏汤.该方药成分包括君药生晒参，健脾益气；臣药壁虎解毒化瘀散结；姜半夏、重楼、陈皮、厚朴共为佐药，化痰行气、清热解毒及消徵散结；炙甘草为使药，调和诸药.五药配伍，共奏益气解毒之功.

网络药理学通过建立“药物-成分-疾病-靶点”的网络关系并对信号通路进行分析，从而系统预测分析药物作用靶点及作用机制[2].本研究采用网络药理学与分子对接技术分析参虎半夏汤治疗胃癌的作用机制及关键活性成分，为进一步实验研究及临床应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 参虎半夏汤化学成分及相关靶点信息的获取

在中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，v2.3)[3]中检索参虎半夏汤中中药的化学成分及靶点.以药物成分口服生物利用度OB≥30%和药物相似性DL≥0.18为筛选条件[4]，获取有效活性成分的靶点.

1.2 疾病靶点的获取

在Genecard数据库[5](https://www.genecards.org/)，搜集与胃癌相关基因(相关性评分限制为不小于5)，获取与胃癌相关的靶基因.

1.3 中药-活性成分-靶点-疾病相互作用网络的构建及分析

利用VennDiagram软件[6]对药物有效活性成分靶点和疾病靶点进行匹配映射，筛选参虎半夏汤中潜在抗胃癌作用靶点，并绘制韦恩图(Veen plot).根据分析所得结果，利用Cytoscape软件构建“参虎半夏汤抗胃癌作用靶点的相互作用网络”拓扑结构并行分析，根据连接度值(degree)筛选该方剂抗胃癌的主要活性成分和作用靶点.

1.4 生物过程GO富集和KEGG通路分析

利用String在线分析平台[7](https://string-db.org/，v11.0)对80个核心基因进行KEGG分析和GO分析，P＜0.01为有统计学意义.

1.5 主要活性成分与核心靶基因的分子对接

在protein data bank(PDB)数据库[8](https://www.rcsb.org/)中下载参虎半夏汤主要活性成分作用于胃癌的核心靶点，并将其保存为pdb格式.使用Autodock及ToolsPyMOL软件对大分子(蛋白质)和小分子(配体)进行前处理.用Autodock Vina软件进行分子对接，能量越低，蛋白质与化合物结合的构象越稳定.挑选出能量最低的结构，用PyMOL软件进行绘图.

2 结果

2.1 参虎半夏汤活性成分筛选

利用TCMSP收集参虎半夏汤6味中药含有的化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件，分析筛选该方剂的有效活性成分.同时，利用该技术平台获取相关作用靶点.数据显示:参虎半夏汤中生晒参22个化学成分，壁虎13个化学成分，半夏13个化学成分，陈皮5个化学成分，厚朴3个化学成分，甘草92个化学成分.

2.2 参虎半夏汤抗胃癌作用靶点筛选

参虎半夏汤中生晒参(SSS)潜在作用靶点有65个，壁虎(BH)有32个，半夏(BX)有51个，厚朴(HP)有18个，陈皮(CP)有46个，甘草(GC)有153个，通过Genecard数据库获取与胃癌相关靶标基因.绘制参虎半夏汤中药有效活性成分抗胃癌作用靶点的韦恩图，见图1，PTGS1、PTGS2为该方中的共同作用靶点.

图1 参虎半夏汤抗胃癌作用靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram on the anti-gastric cancer target of Shenhu Banxia Decoction

2.3 参虎半夏汤有效化学成分-靶点调控网络及拓扑分析

对参虎半夏汤活性物质有关的靶点以及胃癌靶点等进行映射匹配，得到该汤剂潜在活性物质和该疾病的靶点的对应关系，利用Cytoscape软件构建参虎半夏汤“活性成分-靶点”网络，见图2.对其网络拓扑结构进行分析，依据degree筛选参虎半夏汤抗胃癌的重要有效活性成分和作用靶点，见表1.连接度最高的4个活性分子依次为:槲皮素(querectin)、山萘酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)、川皮苷(nobiletin)，它们可能是参虎半夏汤治疗胃癌的潜在有效成分.连接度大于3的靶基因共80个，排名前5的依次为前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、E2F7转录调节因子、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、编码热休克蛋白90(Heat Shock Protein 90，HSP90AA1)和雄激素受体(androgen receptor，AR).

表1 参虎半夏汤潜在活性成分与胃癌疾病靶点相互作用网络拓扑结构分析结果Table1 Topological structure analysis of the interaction network between the potential active components of Shenhu Banxia Decoction and the disease targets of gastric cancer

图2 参虎半夏汤化合物-靶点网络注:黄色表示有效化学成分，紫色表示靶点，绿色表示中药Fig.2 Components-targets network of Shenhu Banxia Decoction

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2.4 活性靶点生物学功能与通路研究

采用DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/，v6.8)对PPI中80个靶点进行GO分析和KEGG通路分析.GO分析结果如图3～5所示，其中生物过程主要包括:对化合物的反应、营养物质的代谢、对脂多糖的反应、生物刺激反应、氧化应激、凋亡信号通路、发育生长等方面；细胞组成主要包括:膜筏、轴突、转录因子复合体、突触前膜、蛋白激酶复合物、质膜蛋白复合物、线粒体膜等方面；分子功能主要包括:核受体活性、蛋白质结构域特异性结合、血红素结合、磷酸酶结合、蛋白激酶活性、组蛋白激酶活性、转录因子活性等方面.KEGG信号通路结果如图6所示，主要富集的通路为癌症通路、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路，并对前列腺癌、小细胞肺癌密切相关.

图3 参虎半夏汤靶标的GO富集分析图(生物过程)Fig.3 Go enrichment map of the target of Shenhu Banxia Decoction(Biological Processes)

图6 参虎半夏汤治疗胃癌相关靶蛋白KEGG富集分析通路图Fig.6 The pathway map of KEGG enrichment analysis in the treatment of gastric cancer with Shenhu Banxia Decoction

图4 参虎半夏汤靶标的GO富集分析图(细胞组成)Fig.4 Go enrichment map of the target of Shenhu Banxia Decoction(Cellular Component)

2.5 分子对接结果及分析

利用Autodock Vina软件，根据表2排序，选出参虎半夏汤的4个主要活性成分:槲皮素(querectin)、山萘酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)、川皮苷(nobiletin)与5个核心靶点蛋白(PTGS2、E2F7、ESR1、HSP90AA1和AR)分子受体相对接，其对接的结合自由能量见表2，其中E2F7、ESR1、HSP90AA1、AR分别与柚皮苷亲和力排名最低，分别为:-27.18、-34.71、-40.14、-36.38 KJ/mol(见图5A～D).说明参虎半夏汤的主要活性成分和核心靶点蛋白具有良好的结合能力，在胃癌治疗中起关键作用.

图5 参虎半夏汤靶标的GO富集分析图(分子功能)Fig.5 Go enrichment map of the target of Shenhu Banxia Decoction(Molecular Function)

表2 分子结合自由能量表Table2 Information of binding energy between active components and core target molecules

图7 药物活性成分-靶点作用模式A Naringenin与E2F相对接 B Naringenin与ESR相对接C Naringenin与HSP90AA1相对接 D Naringenin与ESR相对接Fig.7 Action mode of active components and target

3 讨论

结合文献及临床研究分析，胃癌发生的核心病机为脾胃虚弱，癌毒内阻.参虎半夏汤中君药生晒参主要发挥大补元气功效；人参中提取出主要的有效成分人参皂苷Rg3，多数基础研究显示其具有诱导胃癌细胞凋亡、增殖和迁移的能力[9-11].臣药壁虎主要发挥攻毒散结功效；基础研究显示壁虎含药血清可抑制胃癌细胞增殖，并促进细胞凋亡[12-13].该方剂主要发挥益气解毒功效.前期基础研究通过建立裸小鼠胃癌皮下移植瘤模型，发现参虎半夏汤可抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[14].

本研究利用网络药理学技术分析参虎半夏汤活性成分--抗胃癌作用靶点的相互作用网络图，根据连接度值筛选出该方剂潜在抗胃癌的有效成分为槲皮素、山萘酚、柚皮苷、川皮苷，这4种成分可能为参虎半夏汤治疗胃癌的主要物质基础.我们进一步对有效成分进行文献查阅，有研究发现槲皮素干预后，Caspase-3表达增加，Bcl-2/Bax比值降低，其可能通过线粒体途径诱导胃癌细胞BGC-823凋亡[15].山奈酚是一种黄酮类化合物，研究发现不同浓度山奈酚干预后，胃癌细胞中P53表达水平显著提高，PARP1表达被显著抑制，促进胃癌细胞发生凋亡[16].柚皮苷是天然糖苷之一，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗增殖和抗癌；研究发现柚皮苷可显著抑制胃癌细胞SNU-1生长并诱导细胞周期停滞在G0/G1期和细胞凋亡；其机制与阻断PI3K-AKT信号通路和激活细胞自噬机制相关[17].川皮苷是一种多甲氧基黄酮类化合物，体外研究发现川皮苷可抑制胰腺癌细胞PANC-1的生长，透射电镜观察到川皮苷干预后，PANC-1细胞的细胞核膜破裂，胞质溶出，形成凋亡小体[18].

靶点PTGS2、E2F7、ESR1、HSP90AA1和AR在网络中连接度最高，可能是参虎半夏汤抗胃癌的潜在靶点.其中PTGS1、PTGS2为该方中的共同作用靶点.PTGS2在胃肠道肿瘤炎症性微环境中起着关键作用[19].多项研究表明在胃癌患者中PTGS2蛋白表达与肠组织学亚型，近端位置，肿瘤大小和淋巴结受累相关[20-21]，PTGS2蛋白的过度表达是存活率低的独立预后因素[22].E2F7作为上皮转录因子，在多种恶性肿瘤中呈高表达，主要影响肿瘤的分化、增殖及转移[23].研究显示在胃癌患者中，高E2F7表达与更好的OS显著相关；与较高临床分期(III，IV期)显著相关[24].ESR基因是编码ER的基因，ESR1突变可造成雌激素信号通路失调，对肿瘤进展和耐药有促进作用[25].在胃癌中，ESR可能作为预后指标之一，高表达的ESR1是胃癌患者预后的独立危险因素[26].HSP90AA1，编码热休克蛋白90α(Heat Shock Protein 90α，HSP90α)是一种细胞内的分子伴侣蛋白，参与细胞的生长、分化、代谢及应激等多种生理功能的调控[27].HSP90在胃癌中高表达，通过调节肿瘤生长、侵袭转移、血管生成和细胞凋亡发挥重要作用.多项研究发现，胃癌组织中HSP90α的阳性率较癌旁组织显著增高，与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移及TNM分期相关[28-29].雄激素受体(androgen receptor AR)是核受体超家族中的成员，是一种转录活化因子.研究表明，在胃癌患者中AR的表达是一个独立的不良预后因素[30].AR下调可抑制胃癌细胞迁移和侵袭，并抑制上皮-间质转化(EMT)[31].

KEGG信号通路分析主要富集通路为TNF、PI3K-AKT和AGE-RAGE信号通路.在胃癌的发生发展过程中，TNF-α在炎性和肿瘤的发生过程中起重要联络作用，一方面，TNF-α能诱导炎性反应，另一方面，TNF-α能促进细胞增殖、侵袭及EMT等.PI3KAKT信号通路途径是细胞生长，代谢，存活，转移和对化疗耐药的重要促进剂[32-33].晚期糖基化终末产物受体(Receptor of Advanced Glycation End products，RAGE)是糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)的主要受体之一，但二者的结合并非特异性.研究显示AGE/RAGE信号通路在结直肠癌细胞EMT活化过程中发挥作用，且可通过调控EMT对结直肠癌细胞干性产生影响[34].

综上，本研究通过网络药理学及分子对接技术对参虎半夏汤中有效化合物、靶点及通路进行初步探索，通过多个数据库及软件平台筛选出该方剂的有效成分为槲皮素、山萘酚、柚皮苷、川皮苷，其主要靶点为PTGS2、E2F7、ESR1、HSP90AA1和AR，其作用机制与TNF、PI3K-AKT和AGE-RAGE信号通路高度相关.