基于网络药理学与分子对接技术的菊苣抗高尿酸血症作用机制研究

邵晓妮，丁玥瑶，穆卡然·艾买江，李 娜，吴美薇

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

随着人们饮食的多样化，高嘌呤和高脂肪食物摄入量的增加容易打破人体内尿酸含量的动态平衡，导致多种疾病的发生率增加.高尿酸血症是一种由于嘌呤代谢紊乱导致尿酸过量或尿酸排泄减少而导致血尿酸水平超过正常水平的代谢性疾病[1].据调查研究显示，目前高尿酸血症在中国的总体患病率已达13.3%，成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病[2]，被称作除高血压、糖尿病和高脂血症之外的“第四高”[3].除引起痛风外，也有证据表明高尿酸血症与心血管疾病、慢性肾脏病、糖尿病和其他疾病的发生也有相关联系[4].高尿酸血症与肾病关系密切，其会对肾小球囊内毛细血管细胞的收缩性造成损害，使急性肾损伤发生风险增大[5].高尿酸血症通过激活NLRP3炎症小体、损伤肾小管内皮细胞，刺激TLR诱导炎症因子和血管平滑肌增生，这些都是导致肾病发生的重要因素[6].因此，寻找对高尿酸血症靶向性高、疗效好的药物成分，并对其进行相关研究具有重要意义.

菊苣(Cichorium intybus L.)来源于菊科植物毛菊苣或菊苣，药用部位为其干燥地上部分或根，具有清肝利胆，健胃消食，利尿消肿等多种功效，对治疗水肿尿少、湿热黄疸、胃痛食少等多种病症都有好的疗效[7].菊苣是维吾尔族和蒙古族习用药材，对肥胖、糖尿病、多代谢紊乱等许多方面也具有一定治疗作用[8].根据研究发现，菊苣对于治疗高尿酸血症有明显疗效[9].中药治疗具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点，通过检索网络数据库收集信息，构建针对性的“疾病-靶点-药物成分”的网络关系，从多成分、多途径、多靶点的研究思路出发，可以从整体上对药物的作用靶点及其作用机制进行预测[10].本研究采用网络药理学与分子对接技术研究菊苣抗高尿酸血症作用机制，为其药效机制的深入探讨提供思路.

1 材料与方法

1.1 菊苣化学成分收集及筛选

在中药系统药理学分析平台数据库TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索菊苣，得到菊苣的主要化学成分.以口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18对化学成分进行评估筛选，以得到符合条件的有效成分，进行收集并与本实验室前期研究相结合，整理获取菊苣活性成分，基本建立“菊苣主要活性成分数据库”.

1.2 菊苣活性成分作用靶点收集及筛选

搜集已获取的菊苣潜在活性成分的作用靶点并筛选.在TCMSP数据库中检索活性成分名并整理其靶点，并在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中输入在TCMSP数据库中筛选得到的活性成分，下载分子信息以及化合物结构.UniProt(http://www.uniprot.org/)是国际知名蛋白质数据库，主要包括三个部分:UniRef参考序列集、UniProt-KB知识库和UniParc归档库，其核心数据是蛋白质序列，因此也常被称为蛋白质序列数据库，或简称蛋白质数据库[11].本实验中主要运用UniProtKB知识库，将上述途径进行预测所得化合物靶点合并去重，在UniProt蛋白数据库中统一为靶基因名，建立“菊苣有效成分-靶点数据库”.

1.3 高尿酸血症靶点的搜集和筛选

以“Hyperuricemia”为关键词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)及OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)数据库检索并获得与高尿酸血症相关的基因，将所得结果合并、去重，整合有效疾病靶点，与菊苣活性成分作用靶点进行匹配.安装R语言3.6.3中的“VennDiagram”数据包，作出韦恩图并取其交集，得到各数据集共有的差异表达基因，即可获得菊苣中可抗高尿酸血症的活性成分的潜在作用靶基因.

1.4 构建菊苣“药物-活性成分-作用靶点”网络

将菊苣化学成分及抗作用靶点信息导入Cytoscape3.8.0软件，构建菊苣“药物-活性成分-作用靶点”网络，其中的节点(Node)代表靶蛋白、有效成分或药物，边(Edge)代表节点之间的关系，度数(Degree)和接近中心度(Betweenness Centrality)可反映每个节点的重要性.接近中心度越大，代表与其他所有节点越接近.节点的Degree代表与其相连的边数，Degree值越大，说明该节点参与的生物功能越多，即该节点在网络图中重要性越大.该网络分析进一步推断了菊苣抗高尿酸血症的药理机制.

1.5 构建菊苣治疗高尿酸血症靶点蛋白相互作用网络

STRING数据库(https://string-db.org/)可用于预测靶蛋白之间的相互作用[12].在STRING数据库中导入菊苣抗高尿酸血症的潜在作用靶点，物种设定为“Home sapiens”，获得菊苣治疗高尿酸血症靶点蛋白的相互作用网络，得到靶点蛋白相互作用关系，用R语言计算关键靶点并制图.

1.6 生物过程分析

在R语言中安装Bioconductor相关软件包“clusterProfiler”，以P≤0.05为筛选标准对菊苣活性成分潜在作用靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路分析，筛选出具有显著性差异的生物过程及作用通路，取排名前20的结果整合绘制柱状图和点状图.

1.7 分子对接

在UniProt中搜索上述中得到的核心靶蛋白的PDB ID，利用RSCB PBD数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)检索并下载PBD格式的3D结构文件，然后运用PyMOL、AutoDock Tools 1.5.6对下载的靶蛋白进行前处理，对分子对接的活性位点进行初步确定.用AutoDockVina进行分子对接，由受体与配体的结合自由能可以判断其亲和力大小.

2 结果

2.1 菊苣化学成分及靶点的结果获取

通过查询TCMSP数据库共得到菊苣化学成分52种，其中符合筛选标准OB≥30%、DL≥0.18的化合物有12种，包括Luteolin、Beta-sitosterol、Delphinidin等，其中有2个化合物无靶点，见表1.

表1 菊苣中的主要活性成分Table 1 Main active ingredients in chicory

2.2 菊苣抗高尿酸血症靶点预测结果及韦恩图

用TCMSP搜集以上10种菊苣化学成分的靶点，共得到147个，筛选后得最终有效成分靶点98个.以“Hyperuricemia”为关 键词 在Drugbank、GeneCards、OMIM及DisGeNet数据库中检索与高尿酸血症相关的基因，在OMIM数据库中搜集到疾病靶点15个，DisGeNet数据库中196个，Drugbank数据库中35个，GeneCards数据库中20 396个，四者去重结合后共得到860个高尿酸血症疾病靶点.用R语言将其与菊苣活性成分靶点取交集，共得到39个菊苣抗高尿酸血症潜在作用靶点，采用R语言中的“VennDiagram”数据包作韦恩图并取交集，见图1，菊苣抗高尿酸血症潜在作用靶点见表2.

表2 菊苣抗高尿酸血症潜在靶蛋白信息Table 2 Information of potential anti-hyperuricemic nephropathy targets from chicory

图1 菊苣-高尿酸血症交集靶点及韦恩图Fig.1 Chicory-Hyperuricemiacommunicative targets and Venn Diagram

2.3 菊苣“药物-活性成分-作用靶点”网络构建结果

将菊苣活性成分及成分作用的靶点信息数据导入Cytoscape软件，构建菊苣“药物-活性成分-作用靶点”网络，见图2.

图2 菊苣化合物-靶点网络红色代表靶点蛋白，黄色代表活性化合物Fig.2 Components-targets network of chicoryThered is the targets，the yellow is the main active ingredients

由图可见，网络中共有109个节点，158条边，说明每个活性成分可作用于多个靶点.其中，红色菱形表示菊苣活性成分作用靶蛋白，黄色表示菊苣主要活性成分，边表示相互关系.活性成分DY1表示Poriferast-5-en-3beta-ol，DY2表示Beta-sitosterol，DY3表示Delphinidin，DY4表示Eseramine，Y5表示Luteolin，DY6表示2S，2‘S-Aurantiamide acetate，DY7表示Lactucopicrin，DY8表示(2R)-3-[3-(5-allyl-2-hydroxyphenyl)-4-hydroxyphenyl]propane-1，2-diol，DY9表示Gitoxigenin，DY10表示Cyanidin 3-glucoside＿qt.

2.4 菊苣抗高尿酸血症靶点蛋白相互作用网络PPI构建结果

采用STRING数据库，导入菊苣抗高尿酸血症的潜在作用靶点，构建菊苣治疗高尿酸血症的PPI网络，见图3A.图中节点表示菊苣抗高尿酸血症潜在靶蛋白，边表示靶蛋白之间的关系.与其他蛋白关系越密切，该蛋白越关键，为核心靶点.用R语言计算核心基因，对排名前30的基因进行作图，见图3B.可见TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF为最重要的五个核心基因.

图3 菊苣抗高尿酸血症靶点蛋白相互作用网络图及核心基因A.蛋白互作网络；B.关键基因Fig.3 Protein interaction network and core gene ofchicoryA.Protein interaction network；B.Key gene

2.5 靶点的生物过程分析结果

2.5.1 靶点的GO富集分析结果

采用R语言中的“clusterProfiler”进行靶点的GO分析，共得生物过程77条，取前20条作图，见图4.提示菊苣可能主要参与细胞因子受体结合(Cytokine receptor binding)、细胞因子活性(Cytokine activity)、泛素蛋白连接酶结合(Ubiquitin protein ligase binding)、类泛素蛋白连接酶结合(Ubiquitin-like protein ligase binding)、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合(RNA polymerase II transcription factor binding)等生物过程，发挥抗高尿酸血症作用.

图4 菊苣抗高尿酸血症靶点GO富集分析A.柱状图；B.点状图Fig.4 GO analysis of targets for chicoryin treating hyperuricemiaA.Barplot；B.Dotplot

2.5.2 靶点的KEGG通路富集分析结果

采用R语言进行靶点的KEGG分析，共得到信号通路127条，取前20条作图，见图5.其中菊苣发挥作用涉及信号通路包括IL17信号通路(IL17 signaling pathway)和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等.

图5 菊苣抗高尿酸血症靶点KEGG通路富集分析A.柱状图；B.点状图Fig.5 KEGG pathway analysis of targets for chicoryin treating hyperuricemiaA.Barplot；B.Dotplot

2.6 分子对接结果

采用AutoDockVina，以关键靶蛋白TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF作受体，菊苣的10个有靶点的活性成分作配体进行分子对接，亲和力的大小以结合能来判断，结合能为负值说明活性成分与靶点有亲和力，结果见表3.

表3 菊苣中主要活性成分与选取的蛋白靶点的结合能值(kJ·mol-1)Table 3 The binding energies of main active components in Cichorium intybus with selected protein targets(kJ·mol-1)

活性成分与靶点蛋白的结合能越低，则活性成分与靶点亲和力越大.由上表分子对接结果可知，TP53、IL6、JUN、CASP3、TNF等关键靶蛋白与菊苣有效成分结合能均小于-22.0 kJ·mol-1，分子对接结果说明关键靶蛋白菊苣主要活性成分都具有较好的亲和力，与TP53、IL6、TNF亲和力最大的活性成分为木犀草素，与JUN和CASP3亲和力最大的活性成分为β-谷甾醇.如图6所示，表明木犀草素与受体蛋白的结合具有较高的稳定性.

图6 木犀草素与疾病相关靶点的分子对接模式Fig.6 Molecular docking patterns of luteolin and disease-related targets

3 讨论

菊苣是一种常见的中药，其降尿酸作用在大量实验中有明显表现，且在多篇文献中频频提及.目前临床上常用的降尿酸药物很多会造成肝脏受损，副作用较大，但如果通过肠道途径排泄，便可避免药物经过肝脏.用菊苣从肠道环境着手治疗，可以发挥好的疗效.研究显示，菊苣对于减少尿酸有显著作用作用.菊苣药用价值较好，可长期食用，对于人体有多种好处.然而菊苣成分复杂，具有中药多成分、多靶点、多通路的特点，因此菊苣抗高尿酸血症的作用机制值得深入研究.

本研究运用网络药理学方法，最终得到菊苣主要活性成分10个，其抗高尿酸血症潜在作用靶点39个，GO条目77条，KEGG通路127条.首先对菊苣化学成分及作用靶点进行了研究，根据菊苣“药物-活性成分-作用靶点”网络发现，菊苣具有多成分、多靶点的特点.构建菊苣抗高尿酸血症的PPI网络，其中TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF等靶点处于核心位置，说明有效成分可能通过这些靶蛋白对治疗高尿酸血症发挥作用.IL6属于一种白细胞介素，TNF-α是一种促炎因子.有研究显示，高尿酸血症患者IL6、TNF-α等水平异常增高[13].体内尿酸排泄的主要方式是通过肠道和肾脏，大部分尿酸通过肾脏途径排泄[14].若高尿酸血症患者体内尿酸水平过高，会导致尿酸盐在肾脏堆积，刺激肾小管上皮细胞并放大局部炎症反应，导致促炎细胞因子TNF-α等的释放增加.高浓度刺激与炎症又会诱发肾实质细胞氧化应激损伤，导致炎症反应与肾功能损伤加重[15].黄嘌呤脱氢酶主要存在于肝脏中，是体内合成尿酸的关键酶，可将黄嘌呤、次黄嘌呤氧化生成尿酸[16]，为调节尿酸生成的重要靶点.PTGS2又称环氧合酶2(COX-2)，有研究显示选择性的COX-2抑制剂可显著降低尿酸[17].Li S[18]等研究发现，COX-2参与尿酸诱导的系膜细胞增殖，从而导致肾小球的损伤.Yang B[19]等人通过使用miR-214模拟物和特定的COX-2抑制剂(NS398)来确认这些分子在介导尿酸诱导的小鼠主动脉内皮细胞凋亡或COX-2/PGE2级联激活中的作用，发现COX-2的抑制显著改善了MAEC中尿酸诱导的细胞凋亡反应和PGE2的产生.由此可见，通过抑制PTGS2靶点可实现降尿酸作用.以上验证了菊苣有效成分抗高尿酸血症具有多靶点的特点.

根据GO富集和KEGG富集分析结果，菊苣涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性等生物过程及两条重要的信号通路抗高尿酸血症.抑制炎症反应对治疗高尿酸血症有重要作用.IL17信号通路是近年提出的重要炎症信号通路.IL17是一种新的促炎性细胞因子，以二聚体形式分泌，存在于患者软骨细胞、滑液和半月板中.IL17通过引导分泌前炎症因子和活化中性粒细胞可产生局部组织的炎症反应[20].实验研究表明，IL17与其受体结合并激活下游途径，可诱导促炎细胞因子的表达而引起炎症反应，如IL6和TNF-α诱导的炎症[21-22].细胞因子受体结合过程涉及TNF、IL6等靶点，通过与炎症因子受体结合，抑制炎症因子产生炎症反应，从而促进尿酸在肠道和肾脏中的排泄，对高尿酸血症的治疗发挥作用.如TNF-α在炎症过程中起着关键作用，这是导致肾小管间质和肾小球损伤的重要病理机制之一[23]，与高尿酸血症有密切联系.由此推测，IL17信号通路可能与高尿酸血症的形成有密切联系.此外还涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路.晚期糖基化终末产物(AGEs)是还原糖与脂质、蛋白质和核酸的非酶促合成产物.AGEs与晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合，可在各种细胞和器官中诱导氧化应激和炎症反应[24].有研究发现，当尿酸刺激的人脐静脉内皮细胞时，RAGE和高迁移率族蛋白1(HMGB1)的mRNA的表达增加，HMGB1与RAGE结合活化NF-κB信号，促进促炎性细胞因子IL6、TNF-α、粘附分子细胞间细胞粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的释放.且高尿酸血症患者血清RAGE水平与血清尿酸呈正相关[25].可见，菊苣成分可通过AGE-RAGE信号通路抑制促炎细胞因子的表达，发挥对高尿酸血症的治疗作用.上述印证了菊苣有效成分抗高尿酸血症具有多通路的特点.

由分子对接结果可知，菊苣中主要活性成分与预测得到的重要靶点有较好的结合活性，表明这些成分可能是菊苣抗高尿酸血症的潜在药效物质.已证明木犀草素可以降低TNF-α的水平，其可能是通过涉及TNF、IL6等靶点的细胞因子受体结合通路而实现，且其已被证实能够调控尿酸转运蛋白及其mRNA的表达[26].此外还有研究发现，木犀草素可降低尿酸转运蛋白1(mURAT1)水平，抑制XOD的活性，从而增加尿酸的排泄以治疗高尿酸血症，还可预防晚期痛风和高尿酸血症引起的肾功能不全等疾病[27].在弗氏完全佐剂诱导的大鼠实验中可通过抑制TNF-α、IL-6减少炎症细胞的浸润和滑膜增生[28].可见，木犀草素可通过细胞因子受体结合通路、IL-17等多种通路有效抑制促炎因子，发挥治疗高尿酸血症的作用.此外，山莴苣苦素、菊苣萜苷等成分在菊苣中含量丰富且具有多种药理活性.因此，菊苣抗高尿酸血症更多机制有待研究.

综上所述，本研究通过网络药理学与分子对接技术对菊苣抗高尿酸血症的潜在作用机制进行了活性成分、作用靶点和生物过程的分析，并得出菊苣抗高尿酸血症具有多成分、多靶点、多通路的特点.研究结果提示菊苣有10种重要有效成分，可能作用于TP53、IL6、TNF-α等多种靶点，通过调控多种生物过程来实现抗高尿酸血症的作用.这表明菊苣可能通过这些有效成分成为治疗高尿酸血症的潜在药物.菊苣抗高尿酸血症的成分、靶点及通路丰富，有些虽未在本实验结果中体现，但经研究发现也有较强作用.本研究为进一步深入探讨其作用机制提供了资料参考，相关靶点和通路的精确度还需要实验的进一步验证.