玉米与大豆种间互作对根际细菌群落结构及多样性的影响*

林伟伟,李 娜,陈丽珊,吴则焰,林文雄**,沈荔花**

(1.福建农林大学生命科学学院 福州 350002; 2.福建农业职业技术学院 福州 350303)

全球人口迅速增长给粮食生产带来巨大压力的同时,也给环境生态和农业持续发展带来严重的影响。作物多样化的种植体系,例如作物间套作,是发展可持续农业的可行性策略,也是南方多熟种植制的主要 技术手段。与单作处理比较,豆科(Leguminosae)与禾本科(Gramineae)作物合理间套作,彼此对营养吸收和产量表现均有明显的互惠作用。因此,在传统农业实践中,特别是我国南方各省,人们常利用这一技术来发展多熟种植制,以提高作物复种指数,达到增加产量的目的。张福锁院士团队研究指出,在全球层面上,间套作设计及管理有两种不同的模式,即以粮食作物与玉米()间作和以禾谷类作物与豆科植物混作或条播间作模式。前者在我国广泛推广应用,该模式共生期短、肥料投入相对高,增产效应大; 后者则在欧洲广泛应用,其共生期长、肥料投入较低,增产效应高。当前中国应用的100多种间作组合中,70%的组合都有豆科作物的参与。豆科禾本科间作体系作为一种可持续发展的种植模式不仅引起了许多国家的关注,而且豆科禾本科作为世界上重要的粮食作物对于保障全球粮食安全具有重要意义。豆科禾本科间作体系被广泛应用的原因在于豆科作物由于自身的固氮作用,能够有效固定空气中的氮,在与禾本科作物间作时,其所固定氮素的一部分可以通过各种途径转移并被禾本科作物所利用,从而提高氮素的利用效率。另一方面,豆科与禾本科作物间作使得地上部以及地下部的时间、空间生态位分离,从而能够更好地利用光、热、水分等资源,同时挖掘土壤中不同层次的养分资源,达到显著提高产量的优势。根际是养分、水分和有害物质进入作物系统,参与食物链物质循环的必经之门户,因此它是植物-土壤-微生物相互作用的重要界面,已成为近年来人们关注的重点领域。

前人对禾本科与豆科作物间套作体系增产机制的研究多集中于补偿效应,即从资源利用生态位分化和种间互惠方面解释增产效应,如玉米||蚕豆()的间作中,玉米根系生长深度高于蚕豆,而蚕豆根系深度更浅,所以它们存在生态位互补效应。从中不难看出,这是基于作物间套作的土地当量比研究增产效果的。但土地当量比,因该常数具有无量纲特性,所以很难直观地反映间套作比单作在单位面积上的产量优势。近年来,研究认为,种间互惠现象在作物间作中更多体现为养分资源利用有效性。比如玉米与蚕豆合理间作,其中豆科作物蚕豆的根系能分泌化感活性物质,如一些小分子有机酸和质子等,活化土壤中难溶性磷元素,提高禾本科作物玉米对土壤中磷元素的吸收能力。选择和补偿效应的贡献在不同间作体系间存在差异,在矿物质营养的获取上,玉米||蚕豆主要依赖于补偿效应,而玉米||鹰嘴豆()在磷获取上既有选择效应,也有补偿效应。可见,种植制度可有效调节作物间的生态互惠关系。

近年来研究认为,豆科禾本科间作作为不同作物种类组合而成的复合群体,对根际微生物数量、生物量及种群结构和多样性有很大影响。沈雪峰等在对甘蔗()花生()间作系统的研究得出,间作与单作相比能够显著提高花生和甘蔗根际土壤细菌及真菌的数量。章家恩等研究表明,间作能显著提高玉米和花生根区的土壤细菌数量,但土壤真菌及放线菌数量只在间作玉米根区得到显著提高。宋亚娜等在对小麦()||蚕豆间作体系的研究中发现,根际细菌群落多样性在小麦和蚕豆生长进入花期时得到显著提高。陈平等研究结果发现,玉米与大豆()套作具有养分资源高效利用、增强土壤肥力和综合高效的特点,该团队研究还认为,增强这两种作物的种间根系互作能有效地促进耗氧性作物玉米根系向水平生长发展,这不仅有利于增强间作作物玉米对水分和养分的利用潜力,又能改善玉米地上部的生长发育,进而实现增产目的; 然而,增强这两种作物的种间根系互作,会引起共生期大豆根系在水平方向上分布减少,也不利其后期的恢复性生长,最终导致叶面积指数(LAI)下降和净光合作用降低,分枝数、分枝荚数减少而减产; 但玉米与大豆间作对根际微生物多样性的影响研究还不深入。国内外已有不少研究表明,根际土壤微生物对植物生长发育起到极其重要的作用,因而被称之为植物第二基因组。根际土壤中庞大的微生物群落彼此形成生命共同体,深刻影响着共生生物的生长发育过程。这是由于根际微生物组能够直接与植物形成共生、寄生或腐生关系,或者通过促进土壤有机质分解和养分转化,参与土壤中生物地球化学过程和生物养分小循环,进而影响植物对营养养分的吸收和生命过程。同时,植物对根系微生物具有选择性,微生物群落的变化也能够影响宿主植物及其共生生物,导致不同的土壤反馈效应。因此,充分理解土壤微生物对间(混)作体系种间互作和多样性-生产力关系的调节机制,对于优化作物系统结构、提高复合作物群体产量和光温等资源利用效率、发展绿色高质量农业具有重要意义。

Biolog ECO生态板技术是利用四唑紫在获得电子后颜色变化的特征来监控和评价微生物对特定底物的代谢能力。由于土壤中的微生物通过呼吸作用,氧化其所吸收的底物以获得能量,该过程中所产生的电子则易于被四唑紫吸收,从而指示微生物利用底物的过程和程度。然而,由于可培养的土壤微生物不到1%,因而采用这种方法有一定的局限性。应用分子生物学方法可以克服上述方法的不足。末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)是一种描述性的指纹图谱技术,基于不同小亚基rRNA基因序列类型之间的末端限制性片段长度多态性。该技术可以从分子水平全面地分析包括细菌和真菌在内的土壤微生物群落种类和功能,可实现土壤微生物的原位测定,同时具有操作简便、高通量以及重复性好等优点。前人研究认为连作会导致土壤微生物种类从营养丰富型的细菌性菌群向营养贫乏型的真菌性菌群转变,禾本科与豆科作物间套种的根际土壤微生物变化方向则相反,即以营养丰富型的细菌菌群为主。然而玉米与大豆间作互惠的机制是什么,尽管前人已从营养生理学角度作了深入研究,但这种种间互作的根际微生物特性还有待进一步研究与揭示。据此,本研究通过局部控制方法,设置无隔、网隔、全隔和对照(单作)处理,由此产生地下部不同的种间根系互作环境,并借助BIOLOG和T-RFLP等技术方法,深入研究玉米||大豆种间互作对根际细菌微生物群落结构的影响及其与产量的关系,以期为深入理解特定作物间套作模式的产量效应和根际微生态特性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地与供试材料

试验地位于福建省莆田市大洋乡瑞云村( 25°43′E,119°5′N,海拔328 m)福建农林大学生命科学学院实习基地。供试土壤类型为棕红壤,土壤肥力良好。其中,pH 6.48,速效氮123.68 mg·kg、速效磷25.06 mg·kg、速效钾80.09 mg·kg。

在2015年3月31日播种前,以复合肥为基肥,施肥量占总施用量(300 kg·hm)的50%,其余用作追肥,于玉米拔节期之前一次性施用。复合肥中三要素含量N、P、K均为15% (即三者比例为1∶1∶1)。试验期间,在玉米拔节期、大豆分枝期和玉米、大豆的花期分别进行定量灌溉和人工除草。

供试玉米品种为广泛推广的‘花糯66’杂交玉米品种; 大豆品种为当地常用丰产品种‘闽豆1711’,株型直立,抗病性好。

1.2 间作比例和分隔试验设计

最佳作物间作比例的确定: 2014年8月进行田间试验。玉米和大豆株行比参考刘朝茂等分别设置为2∶2、2∶3和2∶4,每小区条播玉米两条带,大豆为2、3、4条带,其中大豆株行距为35 cm×35 cm,玉米为30 cm×30 cm,玉米和大豆的行间距为35 cm。每组试验处理重复3次,进行大豆||玉米最优株行筛选。结果认为玉米与大豆间作以2∶3株行比下产量最高,其土地当量比(LER)最大。据此本试验采用这一间作的最佳行比2∶3。

玉米||大豆根系分隔试验设计: 试验于2015年3月进行。采用单因素完全随机设计,试验重复3次。试验地共设15个种植小区,每个小区10 m。玉米||大豆相邻株间分别采用塑料隔膜使种间根系全部隔离(简称“全隔”,polythene film barrier,PB; 使根系、根系分泌物质以及根际微生物无法通过)、300目尼龙网隔离(简称网隔,mesh barrier,MB; 保证种间根系不会互穿,但种间根系分泌物可以相互交流)和未隔离(简称无隔,no barrier,NB; 种间根系可以互穿)3种处理(图1)。在2015年3月31日大豆和玉米同时播种,其中单作玉米株行距为35 cm×35 cm,大豆为30 cm×35 cm,每穴留1棵秧苗。为计算土地当量比,分别以单作玉米(monoculture maize,MM)和单作大豆(monoculture soybean,MS)为对照,种植密度和水肥管理与上述保持一致。

图1 大豆和玉米间作不同分隔处理模式图Fig.1 Intercropped patterns of soybean and maize under different separating treatments

1.3 样品采集

于2015年采用五点取样法采集田间土壤样本,每处理取样3次。在玉米和大豆分别进入成熟期和鼓粒期时,采用铲子收集玉米和大豆表层0～5 cm的土壤,然后用铲子挖出玉米和大豆根部,采集紧贴在根表面的根际土。各处理随机选2个间作带,各取带内3株作物。收集的土壤样品过2 mm筛以去除石头、植物残体和杂物等后,立即放入—80 ℃超低温冰箱保存,用于后期的试验; 另外一部分用于土壤化学性质测定。

1.4 土壤有效养分测定

对处理土壤样本进行土壤氮、磷、钾有效养分含量的测定,测定方法均参照关松荫的方法。

1.5 间作作物产量测定

在大豆和玉米收获前3 d (2015年7月31日)取样测产,采集每个小区的全部玉米穗并人工脱粒,分别装好袋子并标记,烘干称重,计算单位面积产量。同样随机收割每个小区大豆,分别装好袋子和标记,烘干称重,计算单位面积产量。

土地当量比(land equivalent ratio,LER)计算如下:

式中:、分别为间作玉米和大豆的经济产量,和分别是为单作玉米和大豆的经济产量。LER＞1为间作优势,LER＜1为间作劣势。

1.6 根际土壤细菌群落测定

1.6.1 BIOLOG ECO微平板测定法

取上述待测不同处理的大豆和玉米根际土壤样本,采用BIOLOG ECO微平板法进行试验操作: 称取5 g新鲜根际土置于灭菌后的三角瓶中,加入100 mL 0.15 mol·LNaCl无菌溶液,封口,120 r·min恒温振荡器中震荡30 min,冰浴,静置5 min。取上清液5 mL于灭菌的100 mL三角瓶中,加入45 mL上述无菌水,重复稀释3次,制得1∶1000的提取液,用于ELSIA反应。将BIOLOG ECO平板预热到25 ℃,用移液器取150 μL提取液于各个孔中,28 ℃恒温培养,在0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d用ELISA反应平板读数器读取590 nm的吸光值。

1.6.2 T-RFLP测定法

土样DNA提取: 取上述同一处理的土样提取土样DNA,提取方法参照Bioflux公司生产的土壤DNA试剂盒说明书步骤进行,并保存于—80 ℃冰箱。

PCR扩增: 引物序列为27F-FAM (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACC TTG TTACGACTT-3′),其中27F的5′端以荧光染料FAM标记。试验使用PCR扩增仪,使用的反应体系为50 μL体系: 1.0 μL 1492R,1.0 μL 27F,1.0 μL模板DNA,1.0 μL DMSO,1.0 μL BSA,25 μL 2×Taq Mix,20 μL ddHO。扩增条件: 94 ℃变性l min,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.6 min,35个循环; 第一步94 ℃预变性5 min,最后一步结束于72 ℃,继保温10 min,4 ℃保存。之后PCR产物进行切胶回收,并采用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测,按照美国Omega Bio-Tek公司生产说明书的胶回收试剂盒的方法步骤进行回收。

PCR产物酶切: 纯化回收的16s rRNA片段采用4种限制性内切酶(MspⅠ、HaeⅢ、AfaⅠ、AluⅠ)[这4种酶购于宝生物工程(大连)公司]进行4酶切,MspⅠ 或 AfaⅠ的酶切体系(20 μL)为: 10 μL目的片段(0.6～0.8 μg),2 μL 10×T buffer,2 μL 0.1% BSA(TAKARA BIO,Otsu,Japan),1 μL MspⅠ或AfaⅠ (10 U),5 μL ddHO。HaeⅢ或AluⅠ的酶切体系(20 μL)为:10 μL目的片段(0.6～0.8 μg),2 μL 10×L buffer,1 μL MspⅠ或AfaⅠ (10 U),7 μL ddHO。放于37 ℃水浴锅中进行酶切4～5 h,同时在酶切过程中注意避光。由北京诺禾公司测序。

1.7 数据分析

土壤细菌群落ELISA反应采用BIOLOG平板每孔颜色平均变化率(average well color development,AWCD)表示,并参照植物生态学方法计算Shannon-Wiener指数、Simpson指数和McIntosh指数,以比较不同样品的土壤微生物群落结构相似性。数据整理采用Excel 2010,采用DPS 7.05软件进行单因素方差分析,多重比较用LSD法(＜0.05),主成分分析(PCA)采用SPSS 19.0软件进行。

T-RFLP分析的原始数据采用Gene Marker V1.2软件(Soft Genetics LLC,PA,USA)进行图谱分析。每个T-RF的丰度百分比(P)按照以下公式计算:

式中:表示每个可分辨的T-RF片段的峰面积,表示所有T-RF片段峰面积总和。Shannon-Wiener指数()、Simpson指数()及McIntosh指数()采用SPSS 20软件进行计算,计算公式如下:

式中:P代表每个T-RF片段的相对丰度,代表可分辨的T-RF片段总数。分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析。

数据库比对分析使用T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool (PAT)进行细菌限制性片段(T-RFs)的比库分析。

2 结果与分析

2.1 玉米和大豆在不同种间根系互作下的产量表现

由表1可见,全隔、网隔和无隔处理下玉米的籽粒产量随根间互作的增强而提高,其中无隔处理比单作对照显著提高61.02% (＜0.05)。玉米的百粒重与其籽粒产量表现一致,各处理均高于单作,无隔和网隔处理下百粒重比单作百粒重提高21.88%和19.48%(＜0.05)。

表1 种间根系分隔处理对间作玉米和大豆籽粒产量、百粒重和土地当量比的影响Table 1 Effects of partition patterns of interspecific roots on grain yield,hundred-grain weight and land equivalent ratio of intercropped soybean and maize

就大豆产量而言,较单作大豆,无隔和网隔处理的大豆籽粒产量显著提高39.15%和46.25% (＜0.05),而全隔处理则差异不显著; 大豆百粒重的表现与籽粒产量趋势类似,具体为: 网隔＞无隔＞全隔＞单作,其中网隔比单作显著增加9.82% (＜0.05),其他处理之间差异不显著。

就LER而言,无隔处理的LER为1.39,显著高于其他两个处理(＜0.05),说明无隔处理与其他处理相比,土地资源利用效率最高,因而产量表现也最高。网隔处理的资源利用效率次之,其LER为1.13。全隔处理最小,为0.98,说明其资源利用效率不及单作处理。可见,不同根系互作处理对复合群体地上部产量有明显影响,表现在无隔处理的土地当量比最高,因而其复合群体产量也最高,网隔处理(即不完全隔离处理)产量居中,而全隔处理(即全隔)的最低,说明种间根系互作强度增强对作物间作产量具有明显促进作用,这可能与根系互作强度不同导致根系微生物组成差异有关。

2.2 不同种间根系互作下玉米和大豆的根际土壤细菌群落变化

在玉米与大豆间作体系中,每隔24 h测定1次AWCD值,得到其随时间变化的动态图(图2),随着培养时间的延长,微生物对碳源的利用量增加,24～120 h不同碳源被利用的变化方式明显不同。图2显示,玉米和大豆的根际微生物群落均为无隔处理对底物碳源的利用能力高于其他处理,网隔次之,全隔和单作较为接近。可见,无隔和网隔处理下,根际土壤微生物群落对碳源底物利用总能力最强,全隔和单作处理最弱。这说明越强的种间根系互作,微生物群落结构组成也越复杂,其代谢能力也越强。

图2 不同种间根系分隔处理下间作大豆（a）和玉米（b）根际土壤微生物平均颜色变化率（AWCD）随培养时间的变化Fig.2 Changes of average well color development (AWCD) of microorganisms in rhizosphere soil of soybean (a) and maize (b)with incubation time under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.3 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物对碳源底物的利用强度

表2显示,大豆根际土壤微生物对6大类碳源底物利用能力最强的为酚类和羧酸类,对碳水化合物类利用能力最弱; 而玉米根际微生物对酚类和羧酸类(无隔和网隔)或酚类和聚合物类(全隔和单作)利用能力最强,对碳水化合物类利用最弱。对酚类利用能力最强、对碳水化合物类利用能力最弱是两种作物的共同特点。同时,随着种间根系互作的增强,大豆根际土壤微生物对上述6大类碳源利用能力除了酚类和羧酸类有所下降或下降不明显外,对胺类、聚合物类、氨基酸类和碳水化合物类等4大类碳源底物利用分别平均提高181.01%、32.6%、37.84%和78.28%。而玉米根际微生物,除了对酚类、聚合物类和氨基酸类利用水平有所下降外,对羧酸类、碳水化合物类和胺类的碳源底物利用分别平均增加46.26%、6.54%和15.84%。这一结果再次说明大豆和玉米种间根系相互增强对其根际土壤微生物利用碳源效果明显不同。

表2 不同种间根系分隔处理下间作玉米与大豆的根际微生物对碳源底物的利用能力Table 2 Utilization ability to carbon substrates of rhizosphere microbes under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.4 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物群落主成分分析

分析结果如图3所示,与土壤微生物碳源利用功能多样性相关的有主成分1 (PC1)、主成分2 (PC2),两者分别解释了方差变量的27.88%和26.06%。进一步分析结果显示,5种根系互作处理的根际土壤微生物菌群组成得到很好的分离。在PC1上无隔、网隔和全隔处理的间作大豆和单作大豆之间的根际微生物菌群组成有明显差异,分别位于不同的区间(象限),其中无隔和网隔处理的大豆根际微生物聚虽然分布在不同的区间内,但相对距离较近; 而全隔和单作处理的大豆根际微生物组成相近,聚集距离最短;可见,网隔和无隔处理的大豆根际微生物差异相对较小,聚在相近区域,可归为一类; 而全隔与单作处理的大豆根际微生物组成较近,分布距离相近,归为另一类。进一步从玉米根际微生物组成看,无隔、网隔、全隔和单作玉米根际微生物组成分离程度及其表现趋势与大豆相似。其中无隔与网隔处理根际微生物组成多数相叠近,归成一类,而全隔与单作玉米根际微生物组成也相近,可归为另一类。网隔与全隔根际微生物组成存在一个逐渐差异的过渡类型。网隔对无隔处理来说,其根际微生物组成是个渐进变化的过程,并向无隔处理贴近的过渡; 后者(全隔处理)则向单作处理贴近。可见,随着根系互作强度增强对根际微生物的组成与功能的影响变得更加明显。

图3 不同种间根系分隔处理下间作大豆和玉米根际微生物碳源利用特征的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon utilization profiles of microbes in rhizosphere soil under different partition patterns of interspecific roots of intercropped maize and soybean

2.5 不同种间根系互作下间作玉米、大豆的根际土壤微生物多样性

表3结果显示,间作大豆根际微生物的Shannon-Wiener指数、Simpson指数和McIntosh指数均表现出无隔最高,网隔次之,全隔和单作最低的趋势,且全隔与单作之间无显著差异; 而McIntosh指数无隔与网隔间差异显著(＜0.05)。间作玉米根际微生物的Shannon-Wiener指数和Simpson指数也表现出与大豆处理下相同的趋势; McIntosh指数多数情况下,无隔处理最优,网隔处理次之,全隔和单作最低。可见,种间根系互作增强其根际土壤微生物种类的多样性和丰富度。

表3 不同种间根系互作对间作作物根际土壤微生物多样性指数的影响Table 3 Effects of different partition patterns of interspecific roots on soil microbial diversity indexes of intercropped maize and soybean

2.6 不同种间根系互作对间作玉米、大豆根际土壤细菌群落结构的影响

应用T-RFLP分析结果如表4可知,大豆与玉米根际细菌群落Shannon-Wiener指数和McIntosh指数在无隔处理下均显著高于全隔处理(＜0.05),且与网隔处理间无显著差异; Simpson指数在这3种处理间差异不显著。该结果与上述AWCD分析结果相一致。

表4 不同种间根系互作对间作玉米与大豆根际土壤细菌微生物多样性和均匀度指数的影响Table 4 Effect of different partition patterns of interspecific roots on diversity indexes of soil bacteria community of intercropped system of maize and soybean

进一步运用Phylogenetic Assignment Tool (PAT)对细菌类群进行比库分析,结果显示: 除了未分类细菌外,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的细菌种类在6种根际土壤中都是最丰富的。但是,在不同土壤样品中每个微生物类群的种类百分比存在明显差异。

图4的结果所示,在大豆根际土壤中变形菌门在全隔、网隔和无隔处理中所占比例依次降低,分别为41.18%、32.76%和31.34%; 放线菌门在无隔、网隔和全隔处理中所占比例依次减少,分别为27.40%、21.49%和13.24%; 厚壁菌门在3种处理中的变化趋势与放线菌门表现相似,比例依次降低,分别为18.43%、17.29%和15.69%; 拟杆菌门则全隔处理所占比例最高,为10.62%,无隔和网隔处理所占比例依次减少,但两者差异不大(5.82%和5.04%)。在玉米根际土壤中变形菌门表现为全隔、网隔和无隔处理所占比例依次降低,分别为47.61%、38.70%和37.26%; 放线菌门则在无隔、全隔和网隔处理中所占比例依次减少,三者分别为18.34%、17.54%和12.07%; 厚壁菌门也在无隔和网隔处理中所占比例均大于全隔处理(三者所占比例分别为19.92%、19.65%和11.62%); 拟杆菌门则在无隔、网隔和全隔处理所占比例无明显差异,三者所占比例分别为7.28%、7.28%和7.29%。由此可见,随着间作作物根系互作强度的减弱(即从无隔处理向全隔处理变化),大豆根际土壤微生物中的放线菌门和厚壁菌门所占比例均明显减少,而变形菌门所占比例明显增加。但玉米根际土壤微生物在无隔、网隔和全隔处理中除了拟杆菌门无显著差异外,其他变化趋势与大豆表现趋势一致。

图4 种间相互作用对间作大豆与玉米根际土壤微生物群落结构的影响Fig.4 Effect of interspecific interaction on microbial community structure in of rhizosphere soil of intercropped soybean and maize

2.7 不同种间根系互作下间作玉米、大豆根际优势细菌菌群分析

不同处理中最丰富的是变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门细菌(图4)。进一步分析其群落优势种菌群变化,结果发现(表5),大豆根际细菌群落中变形菌门的伯克氏菌属()、脱硫杆菌属())和奈瑟菌属()是优势菌群,后两个属全隔处理均显著高于无隔处理(＜0.05),且网隔处理显著大于无隔处理(＜0.05)。放线菌门的优势种群为棒状杆菌属()、红球菌属()和动孢囊菌属(),这3种优势菌群在不同处理中均为无隔处理＞网隔处理＞全隔处理,其中无隔处理与全隔处理差异达显著水平(＜0.05),红球菌属和动孢囊菌属在无隔和网隔处理之间具有显著差异(＜0.05)。厚壁菌门的喜盐芽孢杆菌属()在无隔、网隔和全隔3种处理的变化中呈现依次减少的趋势,其中无隔处理与网隔处理之间无显著差异,但二者与全隔处理之间差异显著。拟杆菌门中噬细胞菌属()的变化趋势与喜盐芽孢杆菌属的依次减少变化趋势相同。可见,随着种间根系互作的加强,大豆根际土壤中厚壁菌门的喜盐芽孢杆菌属,放线菌门的棒状杆菌属、红球菌属和动孢囊菌属和拟杆菌门的噬细胞菌属优势菌群丰度明显增多,除伯克氏菌属外,其他菌群反之(表5)。

玉米根际土壤细菌群落中,变形菌门的优势种群为无色菌属()、伯克氏菌、假单胞菌属()、艾肯氏菌属()和脱硫杆菌属(表5),其中除脱硫杆菌属外,全隔处理均显著高于无隔处理(＜0.05),伯克氏菌属和假单胞菌属全隔处理显著高于无隔、网隔处理(＜0.05); 脱硫杆菌属表现为无隔和网隔处理均显著高于全隔处理(＜0.05)。放线菌门的优势种群为红球菌属和动孢囊菌属,均表现为无隔处理＞网隔处理＞全隔处理,其中无隔和网隔处理之间无显著差异,无隔处理显著高于全隔处理(＜0.05)。厚壁菌门的杆菌属()和芽孢杆菌属()均呈现无隔、网隔均大于全隔处理,其中杆菌属在无隔与网隔处理之间差异达显著水平(＜0.05),芽孢杆菌属在无隔与网隔处理之间无显著性差异,而网隔与全隔之间的差异显著(＜0.05)。螺旋体门(Spirochaetes)中螺旋体属()和拟杆菌门中噬细胞菌属()的变化趋势分别与杆菌属、芽孢杆菌属在无隔、网隔和全隔处理之间的变化趋势相同。由此可见,与全隔处理相比,无隔和网隔处理下玉米根际土壤微生物中变形菌门的脱硫杆菌属、放线菌门的动孢囊菌属和红球菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属和杆菌属、螺旋体门的螺旋体属和拟杆菌门的噬细胞菌属优势菌群丰度明显增多,其他相应减少。

表5 不同种间根系互作对间作大豆和玉米根际土壤细菌群落的影响Table 5 Effect of interspecific interaction on bacterial community in rhizopshere soil of soybean and maize

3 讨论和结论

本研究结果表明,玉米与大豆以2∶3行比间作时,以无隔处理的土地当量比最大,网隔处理其次,全隔处理最小,说明种间根系互作增加对复合作物群体产量有明显的正效应,这与种间根系互作影响根际微生物组成有关。运用BIOLOG和T-RFLP技术分析结果表明,随着玉米与大豆种间根系从完全隔离向网隔和无隔处理变化,即种间根系互作增强，其根际微生物多样性和均匀度指数均显著提高。AWCD分析结果发现,根际土壤细菌微生物利用6大类碳源底物的共同特点是,对酚类碳源和羧酸类碳源利用能力最强。同时,随着种间根系互作的增强,大豆根际土壤细菌微生物对酚类碳源和羧酸类碳源利用能力有所下降或下降不明显,而对胺类、聚合物类、氨基酸类和碳水化合物类等4大类碳源底物利用能力均明显提高。玉米根际细菌群落,除了对酚类碳源、聚合物类碳源和氨基酸类碳源利用能力有所下降外,对羧酸类、碳水化合物类和胺类的碳源底物利用能力明显增加。究其原因可能是由于种间根系互作导致释放的根系分泌物组成浓度不同,并由此引发根际微生物功能类群变异所致。

前人研究发现,玉米根系释放出比大豆根系更多的酚酸类化感物质,在单作玉米和间作玉米的根分泌物中均能检测到5种酚酸,分别是阿魏酸、对香豆酸、肉桂酸、水杨酸和没食子酸,而在单作大豆根系分泌物中只检测到没食子酸,同时发现玉米||大豆间作能显著提高上述5种酚酸,特别是肉桂酸化感物质的含量。前人研究证明间作玉米可促进大豆对红冠腐病的抗病性。同时发现大豆与玉米的根系互作,可抑制病原菌的生长繁殖,并能有效提高寄主植物基因的表达和相应酶的活性。已有试验证明肉桂酸是抑制该间作作物黑腐病菌的主要化感物质,因而认为大豆与玉米间作是一种可持续防治土传病害的有效手段,应在农业管理实践中加以推广应用。

本研究还发现在玉米和大豆根系互作体系中,变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门都是最丰富的优势菌群。随着种间根系互作的增强,大豆根际中棒状杆菌属、红球菌属、动孢囊菌属、喜盐芽孢杆菌属和噬细胞菌属等优势菌群丰度明显增多,除伯克氏菌属外,其他菌群反之。与全隔处理相比,无隔和网隔处理下玉米根际土壤微生物中变形菌门的脱硫杆菌属、放线菌门的动孢囊菌属和红球菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属和杆菌属、螺旋体门的螺旋体属和拟杆菌门的噬细胞菌属优势菌群丰度明显增多,其他相应减少。从植物营养生理角度,间作系统中玉米和豆科植物分泌的有机酸和黄酮类物质有助于对土壤磷的活化和作物固氮,并提高氮营养供给的营养互补效果。我们以往研究表明作物根系分泌物对根际土壤有差异促抑作用,进而塑造出与之相适应的根际特异细菌生理功能类群。上述这些根际差异细菌微生物,如芽孢杆菌属和红球菌属等是一类很重要的根际促生菌,在土壤养分循环和病菌拮抗中起到重要的调控作用。马瑞霞等和Li等也研究报道了芽孢杆菌等特异根际微生物的酶促活性与互作植物根系分泌的化感物质及其浓度有关,进而影响作物的产量与质量。

总之,本研究认为,玉米与大豆种间根系互作能显著影响根际土壤细菌群落结构与功能。随着种间根系互作强度的增强,即种间根系从完全隔离(全隔处理)到不完全隔离(网隔处理)再到自由开放(无隔处理)变化,根际微生物多样性和均匀度依次提高,其生理功能类型也存在明显差异,对碳源利用总能力不断增强,共同特点是对酚类碳源利用能力均排名第一。同时,随着种间根系互作的增强,其中大豆根际土壤微生物对酚类碳源和羧酸类碳源的利用能力有所下降或下降不明显,对其余4大类碳源利用能力均提高。而玉米根际土壤微生物则表现为,除了对酚类碳源、聚合物类碳源和氨基酸类碳源底物利用能力有所下降外,对其余3大类碳源利用能力显著增强。进一步分析发现,随着种间根系互作增强,大豆根际土壤中棒状杆菌属、红球菌属、动孢囊菌属、喜盐芽孢杆菌属和噬细胞菌属等优势菌群丰度明显增多,除伯克氏菌属外,其他菌群反之。与全隔处理相比,无隔和网隔处理下玉米根际土壤微生物中变形菌门的脱硫杆菌属、放线菌门的动孢囊菌属和红球菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属和杆菌属、螺旋体门的螺旋体属和拟杆菌门的噬细胞菌属优势菌群丰度明显增多,其他相应减少。可见在作物间套作体系中,种间根系及其与微生物存在明显的互作效应,并影响根际的微生物生理类群结构与功能,最终影响作物的籽粒产量,导致土地当量比的差异,这是复合作物群体产生不同产量效应的重要根际微生态学基础。