基于网络药理学探究“黄连-知母”治疗2 型糖尿病的作用机制*

侯桃霞，赵小芳，刘爱萍，高 博，李 钦，2△

（1.甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州730300 ；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）已经成为巨大的且越来越突出的全球性健康问题，是严重威胁人类健康的慢性疾病之一。根据国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据，2017 年全球糖尿病患者总数达到4.25 亿，比2015 年增加了1000 万；此外还有约3.5 亿糖尿病高危人群，预计到2045 年，将会有近7 亿糖尿病患者。我国的患病人数已达1.14 亿，将近全球患者的1/4[1-2]。而在糖尿病的分类中，又以2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）居多，占患病总人数的90%以上。糖尿病已然成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大严重危害人类健康的非传染性慢性疾病。调查显示，糖尿病风暴，不仅会危害公众健康，还会衰减生产力，削弱经济发展。2 型糖尿病发病机制复杂，现在的主要手段是控制病情，延迟病情的发展，尚无有效的方法可彻底治愈。西药主要采用二甲双胍、罗格列酮治疗效果好，但长时间用药会导致耐药性增加，且并未能有效控制疾病的发生发展过程[3]。相较之西药，中药有多成分、多靶点共同作用的优势，但同时造成了中药作用机制阐释上的困难。

糖尿病归属于中医学的“脾瘅”的范畴，常有“三多一少”的症状。而现在2 型糖尿病患者中肥胖占多数且多无“三多一少”的症状[4]，仝小林教授团队[5]认为多因在遗传背景下多食和少动导致的体内营养过剩、糖脂代谢紊乱，以“中满内热”为核心病机。肥胖或超重患者多有过食肥甘或饮食不节的病史，过食伤胃，胃气受损，失于和降，造成食郁中焦。食郁阻滞气机，枢机不利，郁热内生。故将黄连应用于糖尿病郁热虚损各个阶段。黄连苦寒，能燥泄胃肠之湿热，又可清泻心胃之实火，有降糖、降压、解毒等功效[6]。知母苦寒，入胃经可凉胃热，泻火存阴，为苦润清热滋阴要药，可用于高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘等[7]。二药配伍，清热兼顾滋阴生津，可用于治疗邪热伤阴导致的2 型糖尿病[8]。

本文基于网络药理学的研究方法，对“黄连-知母”药对治疗2 型糖尿病的作用机制进行初步探讨，以期为“黄连-知母”的进一步研发提供理论基础。

1 软件及数据库

1.1 软件

Cytoscape 软件（V 3.8.1）。

1.2 数据库

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP V 2.3）；PubChem 数据库；Swiss Target Prediction 数据库；GeneCards 数据库；Venny 在线平台（V 2.1.0）；STRING 数据库（V 11.0）；DAVID 数据库（V 6.8）。

2 实验方法

2.1 活性成分的获取及筛选

在TCMSP 平台分别以“黄连”“知母”为关键词检索，检索到的结果以口服生物利用度OB%≥30%、类药性DL≥0.18 为条件[9]进行筛选，得到的成分作为“黄连-知母”药对的成分。

2.2 靶点的获取及筛选

通过PubChem 数据库检索活性成分SMILES式，将SMILES 式导入Swiss Target Prediction 数据库预测其靶点，以Probability＞0 作为筛选条件，符合条件的靶点作为成分-靶点。

在GeneCards 数据库中，以“Type 2 Diabetes”为关键词检索，将检索到的靶点作为疾病-靶点。

将成分-靶点、疾病-靶点进行映射，得到的靶点作为共有靶点。将共有靶点导入STRING 数据库，绘制共有靶点PPI 网络。

2.3 GO 分析及KEGG 通路分析

将共有靶点导入DAVID 数据库，物种选择为“Homo sapiens”，进行GO 分析和KEGG 通路分析。

3 实验结果

3.1 活性成分筛选结果

共检索到“黄连”成分48 个，筛选后得到14 个成分；“知母”成分81 个，筛选后得到16 个成分。共得到“黄连-知母”药对成分30 个，成分及其归属见表1。

表1 “黄连-知母”药对成分及归属

3.2 靶点的筛选结果

检索共得到靶点1839 个，其中黄连相关靶点416 个，知母相关靶点265 个，检索到的靶点合并去重后共有491 个靶点，成分-靶点可视化网络如图1所示，共有24 个成分参与网络构建（另外6 个成分无预测结果，故舍去）。在GeneCards 数据库共检索到2 型糖尿病疾病相关靶点13131 个。

图1 成分-靶点可视化网络图

采用Venny 在线平台将二者映射，共得到459个靶点，韦恩图如图2 所示。将共有靶点导入String数据库，选取物种为“Homo sapiens”，输出置信度在0.700 以上的结果，如图3 所示。图3 中435 个靶点

图2 成分-靶点、疾病-靶点映射韦恩图

图3 共有靶点PPI 网络图

3.3 GO 分析结果

共有靶点输入DAVID 数据库进行GO 分析，导出GO 分析中的生物过程（Biological Process,BP）富集分析结果。以P-Value＜0.01 为条件，发现“黄连-知母” 治疗2 型糖尿病的过程主要富集在460 条生物过程。将得到的生物过程按照相关基因产生3558 条关系（有24 个靶点未参与网络的构建），平均节点度为15.5，P-Value＜10-16，说明该网络有意义。数由大到小排列，输出前20 条结果，见表2。将前20 条结果以气泡图形式展现如图4 所示。主要有蛋白质磷酸化、信号转导、凋亡过程的负调控、对药物的反应、细胞增殖的正调控等生物过程。

图4 GO 分析生物过程结果气泡图（前20 条）

表2 GO 生物过程分析结果（前20 条）

3.4 KEGG 通路分析结果

共有靶点输入DAVID 数据库进行KEGG 通路分析，对P-Value＜0.01 的结果进行分析，按照相关基因数由大到小排列，输出前20 条结果，见表3。将前20 条结果以气泡图形式展现如图5所示。主要涉及PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、趋化因子信号通路、胰岛素信号通路等通路。

图5 KEGG 通路分析结果气泡图（前20 条）

表3 KEGG 通路分析（前20 条）

4 讨论

在筛选中药成分靶点时，发现黄连、知母二药有190 个重复靶点，占成分靶点总数的38.70%，提示二药有很强协同作用，体现在二药可共同作用于大量相同靶点，功能上可有一定的叠加作用[10]。采用Cytoscape 软件进行多层次分析，将“中药-成分-靶点-信号通路”绘制成可视化图，结果如图6 所示。

图6 中药-成分-靶点-信号通路可视化网络图

由图6 可知，黄连、知母虽然在成分上没有交叉，但二者包含的多种成分作用靶点重合，且多种靶点作用于同一信号通路，这可用于解释黄连、知母相使为用的科学内涵。这也为中药配伍“七情”的进一步研究提供新的研究思路。

以PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）为例，通路图如图7 所示。“黄连-知母”成分可同时作用于PI3K-Akt 信号通路上游、中游、下游多个靶点，且可以通过PI3K-Akt 信号通路作用于MAPK 信号通路、胰岛素信号通路、ErbB 信号通路等多条信号通路。这为中药多成分、多靶点、作用机制复杂提供又一理论依据。如图7 所示。

图7 PI3K-Akt 信号通路图

在对KEGG 富集分析的过程中，重点对信号通路的结果进行了统计分析。此外，在对疾病的富集结果中我们发现直接富集到“2 型糖尿病（hsa04930:Type II diabetes mellitus）”的结果（p-Value=5.72×10-9），相关基因有17 个（PRKCE、INSR、PIK3CD、PIK3CB、PIK3R1、TNF、PRKCZ、MTOR、PIK3CG、GCK、MAPK10、IKBKB、MAPK9、MAPK8、PIK3CA、MAPK1、MAPK3）；在对生物过程的富集结果中我们发现直接富集到“胰岛素抵抗（hsa04931:Insulin resistance）”的结果（p-Value=9.06×10-9），相关基因有25 个（GSK3B、PIK3CD、PYGL、PIK3CB、PIK3R1、TNF、PRKCZ、PIK3CG、IKBKB、MAPK9、RPS6KA3、MAPK8、AKT2、RPS6KA1、AKT1、PTPN1、CPT1A、PRKCE、INSR、STAT3、MTOR、PPP1CA、MAPK10、PIK3CA、RPS6KB1）。从疾病、生物过程的富集结果可说明“黄连-知母”可调节胰岛素抵抗作用从而达到治疗2 型糖尿病的作用。这与2 型糖尿病的治疗原则相一致，说明网络药理学的研究结果可信度较高，对“黄连-知母”的进一步研究有一定的指导作用。