基于网络药理学分析心宝丸治疗病态窦房结综合征的成分与机制

赵慧敏，邢方凯，杨昌林△

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九七零医院高干一科，山东烟台 264001；2.中国人民解放军71217部队，山东烟台 266600)

病态窦房结综合征(sick sinus syndrome，SSS)也称为窦房结功能障碍(sinus node dysfunction，SND)，由窦房结节病变引起，表现为心脏起搏功能受损和冲动传递异常的一系列症状，通常包括房性缓慢性心律失常、房性快速心律失常、快速型和慢性型心律失常并存的“快-慢综合征”[1]。SSS所引起的心律失常可能会导致心肌和组织灌注不足，从而出现疲劳、头晕、心悸和晕厥等症状，严重时可危及患者生命。目前，针对存在明显心动过缓、窦性停搏的患者，治疗方式以置入心脏起搏器为主，具有有创性、存在多种并发症、治疗和维护费用高等不足[2]。心宝丸有温补心肾、益气助阳和活血通脉的功效，在治疗各种心律失常，尤其是SSS等缓慢型心律失常中具有一定的疗效；然而，目前对于心宝丸治疗SSS的机制仅从中医理论进行解释，其药物有效成分及其与机体相互作用的关系尚缺乏认知。网络药理学分析是近年来被广泛应用的研究方法，可以通过结合中药的成分化学，将药理学信息与疾病相关基因联系起来，通过全面分析药物成分、生物学功能、基因和蛋白质间相互作用网络，尝试阐释中药单药或方剂的治疗机制，为中医药的临床应用提供依据。目前国内外关于心宝丸的网络药理学分析研究较少，现将心宝丸治疗SSS的机制报道如下。

1 资料与方法

1.1 主要成分的检索、筛选和作用靶点的确定

通过TCMSP(https://tcmspw.com/)和中国天然产物化学成分库(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/)，分别以洋金花、人参、肉桂、附子、鹿茸、冰片、人工麝香、三七、蟾酥为关键词检索各味中药的化学成分。以口服利用度大于或等于30%且类药性大于或等于10%作为筛选条件，对检索到的化学成分进行筛选。使用TCMSP数据库和已发表文献对筛选出的化学成分对应的靶点进行查询，并将靶点与Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)进行匹配和规范。

1.2 SSS相关靶点的搜集、筛选和匹配

通过在Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)、Genecards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http://www.omim.org/)及DisGeNet数据库(https://www.disgenet.org/)中检索sick sinus syndrome，将检索获得的重复内容去除。将SSS相关靶点与心宝丸有效成分对应靶点进行映射，绘制韦恩图(Venn diagram)并提取心宝丸有效成分治疗SSS的潜在靶点基因。

1.3 药物-有效成分-靶点网络的绘制

使用Cytoscape(V3.7.2)软件对搜索到的各味药物及其有效成分和作用靶点进行可视化处理，其中，以各味药物及其有效成分和作用靶点作为节点，以三者间的相互关系作为连接线，构建药物-有效成分-靶点网络。对构建的网络进行拓扑学分析，计算每个节点的度值(degree)和中介核心性(betweenness centrality)，以度值和中介核心性评价不同节点的重要性(值越大代表在网络中的重要性越高)。

1.4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路和基因本体(GO)功能分析

使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)和Metascape数据库(http://metascape.org/)对潜在靶点基因进行KEGG信号通路和基因本体功能的富集分析，使用R语言ggplot2包对其中P<0.05的信号通路和功能进行图形化显示。其中，基因本体总共有三大类，分别是生物学过程(biological process,BP)、细胞定位(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)，各自描述了基因产物可能行使的分子功能，所处的细胞环境，以及参与的生物学过程。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及核心靶点的筛选

使用Cytoscape插件BisoGenet(V3.0.0)构建心宝丸有效成分治疗SSS的潜在靶点基因的PPI网络，并对构建的网络进行拓扑学分析，计算每个节点的度值和中介核心性，以度值和中介核心性的2倍中位数为截点，获取PPI网络的核心靶点网络。

2 结 果

2.1 心宝丸活性成分及其靶点

通过TCMSP 数据库初步提取化学成分，其中，洋金花76种，人参190种，肉桂100种，附子65种，冰片31种，鹿茸37种，麝香11种，蟾酥3种，三七119种。经过口服利用度和类药性筛选后获得的化学成分中洋金花12种，人参18种，肉桂5种，附子5种，冰片2种，鹿茸11种，麝香9种，蟾酥1种，三七8种。再将上述化学成分输入TCMSP 数据库，搜索与之相对应的成分作用靶点，合并以后删除重复值共得到有效成分作用靶点271个。心宝丸药物-有效成分-靶点网络内重要性排前10的有效成分中，来源自人参的有5种(山柰酚、人参二醇、人参皂苷Rh2、人参炔C和β-谷甾醇)，三七2种(9,12-十八烷二烯酸甲酯和10,13-十九碳二烯酸)，洋金花2种(白曼陀罗素和东莨菪碱)，肉桂1种(桧烯)，见图1。

2.2 心宝丸治疗SSS的核心靶点及蛋白质相互作用关系

通过Drugbank和Uniprot 等数据库检索，共收集到1 165个SSS相关靶点。将心宝丸有效成分靶点和SSS相关基因进行匹配后，得到31个心宝丸治疗SSS的潜在靶点基因，见表1。

表1 心宝丸有效成分治疗与SSS的潜在基因

续表1 心宝丸有效成分治疗与SSS的潜在基因

2.3 心宝丸有效成分治疗SSS核心靶点的KEGG信号通路

KEGG富集分析显示，在得到的131条信号通路中，包括PI3K-Akt、MAPK、cAMP、胆碱能突触、AGE-RAGE、心肌细胞中的肾上腺素受体、肾素分泌、胰岛素分泌、多巴胺能突触和醛固酮调节钠重吸收等信号通路，见图2。

图2 心宝丸有效成分治疗SSS核心靶点的KEGG分析气泡图

2.4 心宝丸有效成分治疗SSS核心靶点的基因本体功能分析

基因本体功能富集分析显示，在总共1 220项功能中，生物过程1 089项，主要涉及心脏过程、血液循环、NO相关反应、体液调节、细胞对药物的反应、循环系统中的血管过程、器官生长的调节和第二信使介导的信号等；分子功能74项，主要涉及G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、激酶活性、支架蛋白结合、电压门控离子通道活性、激素结合、蛋白激酶调节活性、有机阴离子跨膜转运蛋白活性和蛋白质同源二聚活性等；细胞定位57项，主要涉及质膜蛋白复合物、突触后膜、细胞间连接、细胞基部、细胞膜穴样内陷、转移酶复合物、转移含磷基团、线粒体外膜和分泌颗粒腔等，见图3。

图3 心宝丸有效成分治疗SSS核心靶点的基因本体功能分析

2.5 PPI网络构建及核心靶点的筛选

使用Cytoscape对PPI网络进行拓扑分析，得到包含20个节点的核心网络，其中，SCN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因是核心靶点，见图4。

图4 心宝丸治疗SSS靶点的PPI网络

3 讨 论

SSS所导致的大脑、心脏、肾脏和其他器官的血液供应不足严重影响患者的生活质量，同时其伴有的心脏猝死风险，明显降低了SSS患者的预期寿命。尽管近年来我国以起搏器为代表的心脏植入性器械手术量明显增加，但远不能满足治疗需求[3]，且治疗费用和治疗不良反应率较高，限制了起搏器在SSS治疗中的应用[4]。研究相关中药治疗SSS等疾病的机制，有助于在现有条件下提高SSS患者的生活质量和生存预期。

本研究通过在相关数据库中分析心宝丸的有效化学成分，并对口服利用度和类药性进行筛选后获得了心宝丸中9味中药材的71种有效化学成分及271个有效成分作用靶点。在构建和分析心宝丸药物-有效成分-靶点网络后，可见在重要性前10的有效成分中，人参有5种，三七3种，洋金花2种，肉桂1种，这提示人参、三七、洋金花和肉桂在心宝丸治疗SSS中可能具有更加重要的作用。其中，白曼陀罗素除了具有抗癌作用外[5]，还被证实可以与肾上腺素能和多巴胺受体结合，并表现出较高的抗氧化、抗炎症和抑制蛋白激酶活性的作用[6]；东莨胆碱为一种常见的颠茄类生物碱，具有抗胆碱能药物活性，作为副交感神经系统节后M受体的竞争性拮抗剂，具有明显的增快心率作用[7]；山柰酚为广泛存在于茶、蔬菜和水果中的黄酮类化合物，对于包括血管内皮炎症在内的急性和慢性炎性反应具有显著的抑制作用[8]；桧烯[9]、9,12-十八烷二烯酸甲酯[10]、10,13-十九碳二烯酸[11]被证实具有抗炎和抗氧化活性；人参皂苷Rh2[12]、β-谷甾醇[13]、人参二醇和人参炔C作为人参的重要有效成分，在抗氧化应激和炎性反应及治疗缺血性心脏病、急慢性心力衰竭、心律失常等方面的作用均被大量研究所证实。

本研究共收集到SSS相关靶点1 165个，与心宝丸有效成分靶点进行匹配后，得到31个心宝丸治疗SSS的潜在靶点基因。使用潜在靶点基因构建PPI网络及网络拓扑分析，本研究得到了以SCN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因为核心靶点的包含20个节点的PPI网络。SCN5A基因编码心脏钠通道基因的α亚基，SCN5A核心启动子区域和转录调控区域的变异可导致钠通道功能异常，进而影响快速钠电流(Nav1.5电流)[14]；既往SCN10A编码的Nav1.8电流曾被认为仅存在于神经系统中，近年来的研究则显示其与心脏发育异常和传导阻滞等病理过程中存在一定的相关性，在长QT综合征、进行性心脏传导疾病和SSS的发生发展中起到了重要作用[15]。EDN1基因则被认为与窦房结非传导细胞功能的调节；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相关通路在心血管疾病中有重要意义，被认为与冠心病及原发性和继发性窦房结功能障碍的发生有关[16]。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)家族及其相关通路在心血管疾病中参与了多种调节途径，IGF-2能够维持新生血管生成、促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移[17]，并对心肌细胞的氧化应激及线粒体自噬发挥了促进作用[18]。

对心宝丸治疗SSS潜在靶点进行KEGG富集分析，可见PI3K-Akt、MAPK、cAMP、胆碱能突触等可能为心宝丸调节SSS患者功能的信号通路；PI3K-Akt、MAPK、cAMP信号通路为第二信使介导的信号通路，这提示心宝丸可以通过调节SSS患者细胞内第二信使来发挥作用[19]；胆碱能突触相关通路在心脏功能调节中具有抑制心脏搏动、降低血压等作用，心宝丸可能通过抑制胆碱能突触相关途径进而提高患者心率[20]。而GO分析显示，心宝丸治疗SSS的生物学过程集中在心脏过程、血液循环等生物过程，G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、激酶活性等分子功能，而功能定位涉及质膜蛋白复合物、突触后膜、细胞间连接等。

综上所述，白曼陀罗素、东莨菪碱、山柰酚和桧烯等是心宝丸治疗SSS的潜在有效成分，心宝丸治疗作用的核心靶点主要有SCN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因。但由于多种有效成分的相互作用及对窦房结功能调节等机制尚不明确，还有待进一步研究分析心宝丸治疗SSS的具体机制和途径。