促红细胞生成素对大鼠剖宫产后创面愈合的促进作用*

玄振华，王洪萍，朱 坤，贺丽霞，赵 芳△

(1.山东省济南市第二妇幼保健院妇产科 271100；2.山东省济南市人民医院妇产科 271100；3.莱芜职业技术学院康复教研室，济南 271100)

剖宫产是目前全球最常见的腹部手术之一。在过去很长一段时间里，剖宫产率一直在上升[1]。然而，作为一种分娩替代方法，剖宫产是一种对产妇和新生儿健康都具有风险的侵入性医疗行为[2]。许多剖宫产妇女术后伤口出现并发症，包括血肿、伤口感染、伤口分离和伤口裂开[3]。此外，剖宫产术后子宫切口的不完全愈合也可导致许多临床并发症，如子宫破裂、继发妊娠、异位妊娠、异常子宫出血[4]。现在临床已经有包括皮下引流术和子宫修补术等手段来改善剖宫产后伤口愈合[5]，然而效果并不理想。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种造血因子，主要参与红细胞的增殖和分化，增加血液循环中红细胞数量[6]。现有研究认为EPO可促进血管生成，有利于创面及术后伤口愈合[7]。本实验主要研究了EPO对大鼠剖宫产后伤口愈合及组织形态变化的影响，检测了EPO处理后伤口拉伸强度和子宫破裂压力的变化，同时研究了伤口组织中羟脯氨酸及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、成纤维生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31)的表达水平，旨在探讨EPO对大鼠剖宫产后创面愈合的促进作用，以期为临床治疗和用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

妊娠14 d成年雌性Sprague-Dawley大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。大鼠均饲养在无特定病原体(SPF)级动物房内，室温(23±1)℃，昼夜循环12 h。

1.2 仪器与试剂

重组大鼠EPO购自美国R&D Systems公司(货号1306-RE-010)；PrimeScriptTM反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司(货号RR037A)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(货号C0105)；PAS染色试剂盒购自青岛捷世康生物科技有限公司(货号GMS80131.3);酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自南京建成科技有限公司。压力传感器和放大记录器购自美国WPI公司。

1.3 方法

1.3.1实验动物分组与剖宫产手术

将实验大鼠分为对照组(9只)、EPO 10 U/kg组(9只)、EPO 100 U/kg组(9只)，EPO 1 000 U/kg组(9只)。大鼠在饲养环境下适应5 d后进行相应实验，所有实验动物可自由进食、饮水。大鼠妊娠第19天通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。剖宫产手术流程如下[7]：在大鼠下腹部切开3.0 cm，在子宫角中部沿肠系膜边界纵行切口2.0 cm。通过子宫切开术轻轻挤压大鼠幼崽和胎盘并取出，随后对子宫和皮肤切口进行缝合。术后每2 天腹腔注射相应浓度EPO处理1次，在第28天通过过量二氧化碳麻醉并断颈处死大鼠。

1.3.2皮肤伤口拉伸强度和子宫破裂压测定

伤口拉伸强度和子宫破裂压通过压力传感器测量和放大记录器记录。5 mm2×10 mm2皮肤组织在伤口边缘缓慢向反方向拉，破断强度/横截面积可得拉伸强度。将子宫角缝合至子宫瘢痕远端1.0 cm处，以防止输卵管灌注液漏出。将导管从距离瘢痕1 cm处插入子宫内，缝线固定。导管的近端连接一个5 mL注射器，并通过三通阀连接压力传感器，压力传感器与放大记录器相连。随后向子宫内缓慢注入生理盐水直至子宫破裂或渗漏，所获得的最高压力为子宫破裂压。

1.3.3羟脯氨酸检测

根据ELISA试剂盒说明书，对4组大鼠伤口组织上清液进行羟脯氨酸测定，试验重复3次。

1.3.4组织学分析

将大鼠用过量乙醚麻醉后取伤口组织和子宫组织(右子宫角)。子宫组织快速固定于4%多聚甲醛缓冲液中，24 h后进行石蜡包埋处理。用切片机制作4 μm厚度组织切片，HE或PAS染色观察子宫组织形态学变化。

1.3.5实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

通过TRIzol试剂盒从伤口组织中提取总RNA。RNA通过PrimeScriptTM反转录试剂盒反转录成cDNA，随后将cDNA作为RT-qPCR的模板，在iQTMSYBRE Green Supermix(Bio-Rad)体系中进行实时PCR。引物序列设计如下，TGF-β1：上游引物5′-CCA AGC TTA TGC CGC CCT CCG GGC-3′；下游引物5′-GCG TCG ACC AGC TGC ACT TGC AGG AG-3′;bFGF：上游引物 5′-TGC CAG TGG TTA CGA TT-3′;下游引物5′-TAG GAA TAC TGC CAT CAC-3′；CD31：上游引物5′-CCG CTC GTG AAA TGT TTA GG-3′；下游引物5′-CAG AGC AGG GTC CGA GGT A-3′；β-actin：上游引物5′- GGA AAT CGT GCG TGA CAT TA-3′；下游引物 5′- GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′。PCR条件：94 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 34 s延伸，共40次循环。采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 EPO对大鼠皮肤伤口拉伸强度和子宫破裂压的影响

术后第28天，EPO 100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组较对照组皮肤伤口拉伸强度、子宫破裂压显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

A：伤口拉伸强度；B：子宫破裂压；a：P<0.01，与对照组比较。图1 EPO对大鼠皮肤伤口拉伸强度和子宫破裂压的影响

2.2 EPO对剖宫产后大鼠伤口组织中羟脯氨酸水平的影响

术后第28天，EPO 100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组大鼠伤口组织中羟脯氨酸水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

a：P<0.01，与对照组比较。图2 EPO对剖宫产后大鼠伤口组织中羟脯氨酸水平的影响

2.3 EPO对大鼠剖宫产后子宫组织形态的影响

HE染色结果显示，与对照组大鼠子宫内膜组织比较，EPO 100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组大鼠子宫内膜上皮高度、子宫内膜腺体数量及活性(箭头所示)、子宫血管密度显著增加。PAS染色结果显示，EPO 100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组大鼠子宫内膜腺体活性(箭头所示)及子宫血管密度增加，见图3。

S:子宫内膜上皮高度;G:子宫内膜腺体数量；Bv:子宫血管密度。图3 EPO对大鼠剖宫产后子宫组织形态的影响(200×)

2.4 EPO对大鼠剖宫产后伤口组织中TGF-β1、bFGF、CD31表达的影响

与对照组比较，10 U/kg组、100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组大鼠伤口组织中TGF-β1 mRNA相对表达水平显著增加(P<0.01，P<0.001)，而EPO 100 U/kg组、EPO 1 000 U/kg组伤口组织中bFGF、CD31 mRNA的相对表达水平也显著增加(P<0.01)，差异均有统计学意义，见图4。

A：TGF-β1;B:bFGF;C:CD31；a：P<0.01，与对照组比较。图4 PCR检测EPO对大鼠剖宫产后伤口组织中TGF-β1、bFGF、CD31表达的影响

3 讨 论

研究[8]表明，通过剖宫产手术分娩的女性再次受孕期间子宫破裂风险将会上升。虽然剖宫产后子宫瘢痕破裂的风险相对较低，但皮肤伤口并发症及子宫切口不完全愈合并发症仍然影响孕妇和婴儿的健康[9]。本实验通过检测EPO处理后剖宫产大鼠皮肤伤口拉伸强度和子宫破裂压，发现EPO可显著增加大鼠剖宫产后皮肤伤口拉伸强度和子宫破裂压。为了查明EPO促进愈合的机制，本研究检测了EPO对剖宫后大鼠伤口组织中羟脯氨酸水平的影响，结果发现，100 U/kg和1 000 U/kg的EPO可显著升高子宫内膜腺体数量和子宫血管密度，显著增加伤口组织中羟脯氨酸的水平；同时，伤口愈合过程需要新的胶原蛋白合成，体内大约99.8%的羟脯氨酸储存在胶原中，因此羟脯氨酸的测定可以作为胶原总量的标志物[10]。以上证据证明了EPO对剖宫产术后伤口愈合具有促进作用。

EPO是促进哺乳动物红细胞增殖和分化的主要细胞因子，现有研究表明，EPO可促进创伤愈合并减少炎性反应，保护组织，促进血管再生及伤口的重构[11-12]。吕大伦等[13]研究发现，EPO治疗14 d后，大鼠急性创面可全部愈合，而EPO在剖宫产后的伤口愈合中的研究却未见报道。在皮肤和子宫组织中，拉伸强度是评价伤口愈合最常用的参数。较高的拉伸强度反映了较快的愈合过程，而瘢痕组织的拉伸强度明显弱于正常组织。子宫创伤的愈合不良可以增加子宫破裂的风险，而愈合良好的子宫可以降低破裂的风险。血管生成是伤口愈合过程中必不可少的环节，现有研究也显示EPO具有促进血管生成的作用[14]。本研究HE和PAS染色结果显示，EPO可显著增加子宫内膜腺体数量和子宫血管密度。

伤口愈合是一个复杂的信号传导过程，曾娟妮等[15]研究报道TGF-β1/Smad3信号转导通路参与皮肤创面愈合过程，抑制该通路可促使创面愈合速度加快。血小板和白细胞释放的 TGF-β1是一种多功能细胞因子，在细胞迁移、增殖、分化、凋亡和细胞外基质中起着重要作用[16]。而本研究发现伤口组织中TGF-β1 mRNA相对表达水平升高。TGF-β1在EPO促进伤口愈合中的作用还需要进一步研究。bFGF是成纤维细胞和血管内皮细胞的调节因子，在组织再生和修复中发挥重要作用[17]。本研究结果显示EPO可显著升高伤口组织中bFGF mRNA相对表达水平。CD31是细胞黏附分子Ig超家族成员，可在血管和造血细胞中表达，CD31在炎症中起着至关重要的作用，现有研究认为CD31是慢性炎性反应的负调节因子[18-20]。本研究结果显示EPO可能通过上调CD31的表达来减轻炎性反应。本研究仍有诸多不足之处，对于子宫内膜厚度和子宫内膜腺体数量的测算基于HE染色观察，精密的计算仍有待进一步研究。

综上所述，本研究结果显示EPO可通过增加TGF-β1和bFGF表达，减轻炎性反应，促进剖宫产后伤口愈合，为临床剖宫产术后并发症提供了新的治疗途径。