GNL3L通过MAPK通路促进结直肠癌的发生发展

张条条，许志华，徐昌隆

(温州医科大学附属第二医院消化内科，浙江 温州 325000)

0 引言

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上最常见的癌症之一[1]。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率在所有癌症中排名第四[2]。目前，根治性手术仍是结直肠癌唯一有效的治疗方法，早期发现结直肠癌对患者的预后至关重要。约35%-55%的晚期结直肠癌患者出现肺、肝脏转移[3,4]。总的来说，传统治疗方法(手术、放疗、化疗、中药治疗)疗效不显著。因此，临床迫切需要新的治疗靶点来治疗结直肠癌。

GNL3L是一种含582个氨基酸的GTP结合核仁蛋白，在核仁前rRNA加工和细胞增殖中发挥作用[5-6]。在乳腺癌细胞MCF-7[7]中，GNL3L作为一种核细胞质穿梭蛋白，通过其C端的核输出信号区能够与出核因子1(Chromosome region maintenance1，CRM1)相互作用调节细胞周期。Thoompumkal等人报道GNL3L能与癌症亮氨酸拉链下调因子1(Leucine zipper down-regulated in cancer-1，LDOC1)相互作用，并在肿瘤发生过程中通过NF-κB通路调控HEK293T细胞的增殖和凋亡[5]。

然而，关于针对GNL3L在结肠癌进展中作用的研究相对较少，其潜在机制尚不清楚。因此，本研究的目的是利用公共数据库研究GNL3L在结直肠癌中的表达、功能和机制。我们的研究结果表明，GNL3L在结直肠癌组织中高表达并对预后有影响，并可能对MAPK信号通路产生影响。

1 材料和方法

1.1 公共数据库检测结直肠癌中GNL3L的表达水平

首先我们在GEPIA中检索癌组织中GNL3L的表达情况，并比较结直肠癌与对照组的表达差异。然后，在CCLE中下载57个结直肠癌细胞系的GNL3L表达数据。接着，在GEO数据库筛选12个微阵列的数据，样本信息见表1。数据均来自2019年11月之前上传的微阵列和RNA测序实验。之后我们在R环境下应用RMA算法对原始GEO数据进行归一化并转换为表达值(v3.5.3)[8]。使用R的“sva”包来移除跨平台的批处理效果。比较肿瘤组织和癌旁组织中GNL3L在单系列数据集和单平台数据集的表达情况。最后采用标准化均值差法评估连续变量GNL3L的表达。当异质性(I2)＞50%时，将数据与随机效应模型相结合。结果以森林图的形式呈现。

表1 从GEO中选择的数据集

1.2 GNL3L的临床特征分析

我们从TCGA数据库中提取GNL3L的表达数据及其对应的临床信息。使用Perl软件对每个表达式的重复数据进行平均，并进行均一化处理。结合TCGA提供的年龄、性别、肿瘤分期、组织学分级等数据进行单因素和多因素Cox分析。

1.3 生物学功能分析

通过GEPIA和Coexpedia在线工具筛选可能参与结直肠癌发展的GNL3L相关基因[9]。然后，利用DAVID 6.8进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。使用t检验进行两组之间的比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GNL3L在结直肠癌组织和细胞系中过表达

TCGA数据库中，GNL3L在结肠癌组织中过表达(见图1A和B)。基于CCLE数据，GNL3L在不同类型结直肠癌细胞系中的表达水平与结直肠癌组织趋势一致(见图1C)。在12个GEO基因芯片中，结直肠癌组织中GNL3L的表达水平较对照组织明显升高(见图1D)。在同一平台中去除批次无效应后也观察到这一趋势。综合meta分析显示，GNL3L在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织(SMD=2.20，95%置信区间(CI)：1.42-2.98；P＜0.001)(见图2A)。此外，森林图去除批次效应在结直肠癌组织中呈现一致的表达趋势(SMD=2.10，95% CI：1.29-2.92，P＜0.001)(见图2B)。

图1 GNL3L在数据库中的表达情况

图2 GNL3L表达的森林图

2.2 GNL3L在结直肠癌中的临床价值评价

我们在TCGA中提取结直肠癌患者GNL3L的表达值及其临床特征信息，发现GNL3L的表达和性别、淋巴结转移、肿瘤组织密切相关(见表2)。然而，GNL3L与其他临床参数没有显著关联。这可能是由于样本量不足。随后，我们通过单因素Cox分析发现，GNL3L表达水平、年龄、TNM、肿瘤分期与预后显著相关。同时，多因素分析显示GNL3L表达水平、年龄、N分级、M分级可能是结直肠癌患者的独立预后因素(见表3)。

表2 GNL3L的表达及与结直肠癌临床病理特征的关系

表3 结直肠癌患者总生存期的Cox回归模型分析

2.3 利用公共数据库分析GNL3L的生物学功能

为了明确GNL3L潜在的生物学功能，我们分析了与GNL3L表达相关的基因表达变化。利用GEO和TCGA数据分别通过Coexpedia和GEPIA构建GNL3L共表达网络。接着，利用DAVID工具对鉴定的共表达基因进行GO和KEGG通路富集分析(见图3A和B)。KEGG通路分析显示，富集最显著的通路与“核糖体”“泛素介导的蛋白水解”“甲状腺激素信号通路”“细胞周期”和“MAPK信号通路”相关。

图3 GNL3L在结直肠癌中的生物学功能分析

3 讨论

结直肠癌的发生发展是一个复杂的多步骤过程，可能受癌基因和抗癌基因之间的不平衡以及相关信号通路的改变所影响。然而，我们对结直肠癌的发展和发病机制的认识仍然不完整。因此，明确结直肠癌的分子机制，为结直肠癌靶向治疗确定新的生物标志物是当务之急。GTP结合蛋白可水解三磷酸核苷酸，作为信号转化器或分子开关，参与细胞信号传导、细胞内运输、增殖、分化和凋亡等关键细胞事件[7,10,11]。在人类疾病中已经观察到异常的GTPase信号，包括许多不同类型的癌症。人们对确定GTP结合蛋白在癌症发展和进展中的潜在作用越来越感兴趣。

GNL3L是GTP结合蛋白家族的成员，是脊椎动物核干细胞因子(Nuleostemin，NS)和GNL2的同源类似物。NS在胚胎神经干细胞中优先表达[12]，与NS一样，GNL3L也参与细胞生长和增殖[13]。最近的一项分析发现，与配对的正常组织相比，各种肿瘤中GNL3L表达水平显著升高，尤其是结直肠癌、食管癌和胃癌[14]。我们的结果与这个分析一致。TCGA、GEO和CCLE数据库的数据显示，结直肠癌中GNL3L的表达显著升高。

然而，目前尚不清楚GNL3L如何促进结直肠癌，确定其潜在机制应是未来工作的重点。我们鉴定了与GNL3L共同表达的基因，并进行GO和KEGG富集分析，发现GNL3L的功能可能与MAPK信号通路有关(P=0.03)。MAPK通路在哺乳动物细胞中传递细胞内信号，引起炎症反应和凋亡等生理反应[15,16]。Ras/Raf/MEK/ERK途径是经典的信号转导途径，具有MAPKs的三级酶级联反应[17]。ERK/MAPK通路的异常激活或失调容易导致细胞增殖和生长失控，导致恶性转化和癌症发展。有研究发现，Ras/Raf/MEK/ERK通路的激活有助于诱导血管内皮生长因子的表达，参与结直肠癌的肿瘤侵袭和转移[18]。考虑到这些特性，我们认为GNL3L过表达可能影响MAPK信号通路，从而促进结直肠癌细胞增殖和生长。

综上所述，我们的研究结果揭示了GNL3L在结直肠癌中过表达，并可能通过影响MAPK信号通路调节细胞增殖。这是GNL3L在结直肠癌发生发展中的致癌信号传导的新机制，提示GNL3L是一种有前景的治疗靶点。