CRISPR/Cas9基因编辑在心血管领域的应用进展

刘洪娟 徐亚伟

(上海市第十人民医院心内科，上海200072)

基因疗法具有治疗1万多种人类单基因疾病的潜力，并能使更多的复杂多基因疾病受益。CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，存在于大多数细菌和古生菌中。原核生物在遭到病毒入侵后，能够把病毒DNA的一小段提取出来并存储到自身基因组上的特定区域，把这个区域称为CRISPR存储空间。当再次遇到病毒入侵时，原核生物能够根据存储的DNA片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。根据CRISPR/Cas系统的特性，科学家将其改造成了目前最高效的基因组编辑工具[1]。其中，CRISPR/Cas9是一种古老的细菌免疫防御系统，于2002年首次在原核生物中鉴定，被重新应用到基因编辑技术中，为研究人员提供了一种革命性的基因疗法工具[2]，2012年，Jennifer和Emmanuelle证明CRISPR/Cas9系统可以在体外切割双链DNA[1]；2013年，张锋首次用CRISPR/Cas9系统在原核生物 (大肠杆菌) 中实现基因组编辑[3]，目前尚无相关临床水平的应用[4-5]。天然的CRISPR/Cas9系统由三部分组成：SpCas9(以下简称Cas9)、crRNA和tracrRNA。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成guide RNA(gRNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列(图1)。Cas9蛋白要成功识别目标序列必须满足两个条件：(1)sgRNA的5’端20 nt和靶DNA之间碱基配对；(2)靶DNA的3’端有合适的前间区序列邻近基序(PAM)序列。CRISPR/Cas9切割目标DNA后产生双链断裂(DSB)[6]。CRISPR/Cas9最基础的技术就是基因敲除，即在基因的上下游各设计一条gRNA(gRNA1和gRNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂，实现细胞中目标基因的敲除[非同源末端连接(NHEJ)修复][7]。另外，在此NHEJ修复基础上为细胞引入修复模板质粒(供体DNA分子)，会引入片段插入或定点突变，实现基因的替换或者突变[进行同源介导的双链DNA修复(HDR)]，例如对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建[8]。目前，CRISPR/Cas技术已经被广泛地应用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗等相关领域，以往基因编辑同细胞精确编辑的效率通常很低[9]，而CRISPR/Cas9提供可靶向特定精确位点[10]，并且能同时干扰靶向多个基因[11](详见图1)，为研究复杂的多基因疾病提供了新的可能性，特别适用于体外和体内的不同研究，并已用于评估基因功能、疾病建模、转录调控和测试新型治疗方法等多项研究[12]。目前CRISPR/Cas9在肿瘤和遗传疾病治疗中应用较广泛，如肺小细胞癌、胃癌、大肠癌及罕见疾病治疗等[13-15]。正在进行的大多数肿瘤临床治疗试验都采用CRISPR/Cas9来创建用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体T细胞基因编辑(CAR-T)[16-17]。CRISPR系统还用于非基因编辑目的，例如激活和抑制基因表达，以及用于荧光定位标记染色体区域和单个mRNA[18]。另外，CRISPR/Cas9基因编辑已成功构建多种模式动物，如转基因绵羊和基因敲除猪等[19-20]。在过去的十年中，基因组编辑技术的发展从根本上改变了生物医学研究，在肿瘤科研和临床领域已经得到广泛应用，但在心血管领域的相关研究值得总结和探讨。

心血管疾病是中国老年人发病和死亡的主要原因之一，被认为是主要的公共卫生问题。目前基因组编辑工具已被用于探究诸如心肌病、心律不齐等心血管相关疾病的作用机制[12]。且已有研究表明在心肌细胞中特异性表达Cas9并不会影响心脏功能或相关基因表达，Cas9特异性敲入小鼠已被用于编辑心脏Myh6、Sav1和Tbx2061等基因，但目前心血管领域的治疗性基因组编辑研究有限[21]。以下将更具体地描述二者相关研究进展。

1 心脏发育

在心血管系统开始运转之前，胚胎主要通过弥散的方式获取营养和氧气，然而，随着胚胎发育需要，心脏发育将在后续发挥重要作用[22]。研究表明CRISPR/Cas9通过干预心脏再生中的小孔蛋白，心脏发育中的心脏祖细胞迁移和Wnt/β-Catenin信号转导构建斑马鱼心脏发育模型[22]。除了构建动物模型，CRISPR/Cas9还可以通过进行种系基因组编辑参与心脏发育，开发为遗传性心脏病的治疗工具，如使用CRISPR/Cas9在人类生殖细胞中实现对引起肥厚型心肌病的MYBPC3突变的校正[23]。利用CRISPR/Cas9系统生成gtpbp3基因敲除斑马鱼，发现gtpbp3敲除斑马鱼线粒体tRNA代谢异常，异常的线粒体tRNA代谢损害线粒体翻译，产生蛋白酶抑制应激，改变呼吸链复合物的活性，导致胚胎心脏发育的改变，并减少突变斑马鱼心室的短缩，而敲除gtpbp3基因的斑马鱼心室心肌细胞肥大，心肌纤维紊乱[24]，提示CRISPR/Cas9通过干预相关基因编辑参与心脏发育。

2 动脉粥样硬化/心力衰竭

CRISPR/Cas9基因编辑调控心血管相关疾病进展是目前研究热点。如：通过CRISPR/Cas9敲除ApoE/ApoC3基因可构建动脉粥样硬化大鼠模型[25-26]；体内AAV-CRISPR/Cas9介导的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因剪辑可部分挽救LDLR表达并有效改善LDLR突变体诱导动脉粥样硬化表型[27-28]。用慢病毒载体转染Cas9，并引导RNA在谱系阴性的骨髓细胞中引入Tet2和Dnmt3a失活突变，将细胞植入到化疗小鼠体内，持续注射血管紧张素Ⅱ，Tet2或Dnmt3a失活突变的小鼠表现出更明显的心肌肥厚，心功能减弱，以及更严重的心脏和肾脏纤维化[29]。通过CRISPR/Cas9靶向Mef2d表达的gRNA载体可以有效构建心肌肥大表型[30]。将CRISPR/Cas9与短模板寡核苷酸结合，在斑马鱼的同源基因中产生四种携带不同的导致人类心血管疾病ATP敏感钾通道与Cantu综合征相关(Kir6.1、KCNJ8、SUR2和ABCC9)的基因突变，导致心室明显增大，心输出量和收缩功能增强，脑血管明显扩张[31]。以上说明基因编辑在诱导心血管疾病中具有重要作用，同时其在治疗心血管疾病基础研究中也发挥同等作用，如： CRISPR/Cas9介导FKBP5基因缺失，通过正反馈回路增强FKBP5对核因子κB的反应，具有治疗急性心肌梗死的作用[32]。CRISPR/Cas9敲入表达双重趋化因子GCP-2和SDF-1α的骨髓间充质干细胞可能是缺血性血管疾病的替代治疗选择[33]。即CRISPR/Cas9为心血管相关疾病研究提供新的方法论。

3 心血管临床前基因治疗研究

目前在临床水平通过基因组编辑可以治疗或预防两种类型的心血管疾病，第一类是心血管伴有遗传的疾病，如肥厚型心肌病、扩张型心肌病、先天性长QT综合征和引起心脏功能障碍的肌肉营养不良，第二类是马凡综合征和家族性肺动脉高压等疾病[19，21]。另外，随着人类诱导多能干细胞的发展，CRISPR/Cas9敲除和敲入特定基因的干细胞可显著增加治疗心血管疾病的可能性[34]。如采用CRISPR/Cas9技术将TALEN基因敲入人类诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞中，以纠正PLN基因中与扩张型心肌病相关的基因突变，并在体内(通过腺相关病毒)向小鼠施用该系统，被证明可改善压力超负荷期间或诱发心肌梗死后的心脏功能[21，27]。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因在调节胆固醇稳态中起着重要作用，PCSK9基因的功能获得性突变可导致高胆固醇血症和相关的动脉硬化，CRISPR/Cas9敲除PCSK9基因将增加成年小鼠的LDLR表达并实现临床治疗作用[22]，提示CRISPR/Cas9在心血管疾病基础研究治疗中均发挥有效作用，但目前尚无心血管领域的直接临床应用。

综上，CRISPR/Cas9代表了基因组编辑技术的突破性进展，为在体外和体内操纵基因组开辟了新途径，尽管到目前为止，小型动物模型研究已经稳定，但仍存在部分基因脱靶效应，会延长基础研究及临床治疗时间，目前尚无法在人类心脏中进行基因校正，在心血管中的应用主要集中在遗传性心脏病临床前动物模型中的直接治疗干预和基础研究[35]，因此可结合相关课题相关研究，发掘新的疾病关键靶点后，采用基因编辑技术干预相关基因，实现基因治疗心血管疾病的可能方案。