猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎二重液相芯片检测方法的建立

曹丙蕾，张 群，刘 敏，王 群，尹伟力

（1.济南海关技术中心，山东 济南 250014；2.青岛海关技术中心，山东 青岛 266114）

猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎是由冠状病毒引起的急性、高传染性腹泻病，它们会导致猪呕吐、水样腹泻和脱水，临床表现较为相似，在发病机制、病理变化及流行病学上难以鉴别诊断[1]。液相芯片技术就是一种新型快速高通量的检测技术，将PCR的多重性和液相芯片检测的快速性有效地结合起来，在疾病检测、病原微生物鉴定、激素水平测定、药物研发、细胞因子检测等各领域得到了快速发展与应用[4-6]。本研究采用液相悬浮芯片技术建立了PEDV和TGEV的二重鉴别诊断技术，快速有效地对2种病原进行鉴别诊断，为临床样本检测提供高效灵敏的检测平台。

1 材料与方法

1.1 毒株

猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等核酸样本由本实验室保存，PEDV和TGEV等体积病毒液混合制备PEDV和TGEV混合样本。参考磁珠法病毒核酸提取试剂盒说明对病毒样本进行核酸提取。

1.2 试剂与耗材

磁性荧光编码微球（带有anti-TAG标签）、鞘流液（美国Luminex公司生产），TMAC（四甲基氯化铵）、Tris、SDS、链霉亲和素－藻红蛋白（SA-PE）（美国Sigma公司生产），磁珠法病毒RNA提取试剂盒（西安天隆公司生产），一步法RTPCR试剂盒、一步法荧光RT-PCR试剂盒、DL2000 marker等试剂（Ta kara公司生产）。

主要设备包括：Bio-Plex 200悬浮芯片系统（美国Bio-Rad公司生产），核酸提取仪（天根科技公司生产），基因扩增仪（杭州博日公司生产），荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司生产）等。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成

根据GenBank上公布的PEDV和TGEV基因序列，通过DNA Lasergene软件分析基因序列，找出最保守的基因序列，利用软件设计特异性引物，在上游引物5’端添加特异性标签序列（TAG）（与Luminex公司提供x-TAG磁性微球上的anti-TAG序列反向互补），Spacer C9作为引物与TAG的连接臂，下游引物5’端用生物素标记。引物由上海生工生物工程有限公司制备。

1.3.2 二重RT-PCR反应体系的建立

以PEDV、TGEV和PEDV与TGEV的混合核酸样本为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒说明配置50μL反应体系进行扩增，通过退火温度及循环条件的优化，建立二重RT-PCR扩增方法。反应条件为：50℃30 min；94℃预变性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃5 min，4℃保存，反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果[2]，并将PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序，剩余的PCR产物立即用于液相芯片检测[3]。

1.3.3 液相芯片检测体系的建立

（1）杂交。选取带有anti-TAG标签的28号和12号磁性微球各50μL分别在涡旋仪上以最高转速12 000×g悬浮微球，然后在超声清洗仪上超声清洗微球20 s。用1.5×TMAC杂交缓冲液将2种微球分别稀释至终浓度125个/μL制备混合微球工作液，涡旋混匀后向每个反应孔中加入20μL微球工作液。背景对照孔内加入5μL TE（pH8.0）缓冲液，PCR产物2μL加入到反应孔中，TE缓冲液补足至25μL，然后每孔加入含有8 ng/μL SAPE的1×TMAC缓冲液75μL，充分混匀，置于基因扩增仪上95℃5 min，37℃30 min下进行杂交反应。

将板转移到磁力板上，洗去未结合的PCR产物，然后每孔加入70μL TE溶液，摇匀重悬微球，置于Bio-Plex 200上检测分析，以去除本底荧光值BFI后的中位荧光值（MFI）作为样品的中位荧光值，以样品与阴性对照的中位荧光值之比作为Cut-off值，当MFI≥200，且Cut-off值≥3时，认为结果有效，结果判为阳性，否则为阴性。

（2）杂交条件的优化。首先，将杂交温度分别设置为30℃、37℃、42℃、45℃和50℃。按上述步骤进行杂交检测，通过MFI值确定最佳杂交温度。确定杂交温度后，将杂交时间分别设置为25 min、30 min、35 min、40 min和45 min。杂交检测同上，判断依据同上。

1.3.4 特异性检测

分别对混合样本、PEDV、TGEV、PRRSV等核酸样本进行RT-PCR扩增，将扩增产物与偶联的荧光编码微球进行杂交检测，检测所建立的二重液相芯片方法的特异性。

1.3.5 重复性检测

对PEDV与TGEV的混合核酸样本进行3次重复检测，判定二重液相芯片检测体系的重复稳定性。

1.3.6 临床样本的检测及比对

采用建立的二重液相芯片检测方法对36份临床样本进行检测，同时进行荧光定量RT-PCR检测，结果进行比较分析，以验证检测方法的有效性和适用性。

2 结果

2.1 二重RT-PCR扩增结果

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析（见图1）显示PEDV扩增条带大小为137 bp，TGEV扩增条带大小为207 bp，混合样本扩增出137 bp和207 bp的2种目的条带，与预期扩增片段大小一致，测序结果表明与在GenBank上公布的序列同源性为100%。该二重RT-PCR特异性好，对其他无关核酸样本无特异扩增，引物及各模板之间无非特异性扩增，灵敏度较好。

2.2 液相芯片检测体系的建立

2.2.1 杂交温度的优化

有效荧光编码微球数量超过100个，偶联荧光编码微球真实有效。荧光编码微球空白对照MFI值均＜500，测试可判断结果。

不同杂交温度优化检测结果表明在37℃杂交反应时MFI值最高，反应良好，符合判定标准，故最佳杂交温度设为37℃。

2.2.2 杂交时间的优化

不同杂交反应时间优化检测表明，在杂交进行到25 min和30 min时得到的MFI值相近，普遍高于20 min、35 min和40 min的反应值，考虑到实验简便性，最佳杂交时间应选为30 min。

综上分析，在液相芯片检测中，杂交条件定为37℃30min，整个反应用时约4 h，可最终判定检测结果。

2.3 特异性检测

特异性检测结果显示混合样本中的TGEV和PEDV的MFI值均＞200，QC比值明显大于3，TGEV单个样本检测和PEDV单个样本检测的MFI值也均＞200，QC比值明显＞3，而其他无关病毒核酸MFI值＜200，QC比值明显＜3，试验结果有效。该检测方法对含有PEDV与TGEV的混合样本具有较好的特异性，且能根据荧光编码微球的不同进行PEDV与TGEV鉴别诊断，而且对于TGEV和PEDV的单个样本的检测也具有较好的特异性，对其他无关病毒核酸无交叉反应。

2.4 重复性检测

对PEDV和TGEV二重PCR产物重复进行3次的液相芯片检测，均获得较好的结果，各批次间差异不明显，表明该检测体系稳定，重复性良好。

2.5 临床样本检测

从检测结果可知，液相芯片检测法阳性检测结果与荧光定量RT-PCR法检测结果一致，而荧光定量RT-PCR检测存在可疑结果，经测序验证后排除，判定为阴性，故2种方法的检测结果符合率为100%。与荧光定量方法相比，液相芯片检测减少了检测步骤，检出率较高，准确性较高。

3 讨论

目前市场上使用的液相芯片的xTAG微球与anti-TAG微球根据结核分枝杆菌的序列设计，不含有碱基G，x-TAG与anti-TAG互补，杂交温度相同。用带有TAG序列的探针对扩增产物进行目标特异性引物延伸，得到带有TAG序列的单链片段，从而解决杂交温度均匀性问题。

在总结前人研究成果的基础上，在引物合成中引入TAG序列，在PCR扩增中通过引物配对延伸使TAG序列与扩增产物相连，大大提高了与anti-TAG微球的偶联效率。

建立的PEDV和TGEV二重液相芯片检测方法可以快速准确区分诊断PEDV和TGEV混合感染样本，具有较好的特异性.因此，更准确地判断2种症状非常相似的病毒病，为有效控制动物疫病疫情提供技术支持，具有广阔的应用前景。