乳腺宁治疗急性乳腺炎的网络药理学研究*

万 静，陈晓兰，董娜娜，邓铋莉

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2毕节医学高等专科学校，贵州 毕节 551700)

急性乳腺炎好发于哺乳期妇女，多由于产后乳汁瘀积、哺乳不当等原因造成[1]。在临床上，西医主要通过抗生素等药物治疗，或使用穿刺及引流等手术治疗该疾病，预后较好。但对于病程比较长的患者，过量使用了抗生素，哺乳会造成孩子出现一些菌群失调、腹泻等症状；采用手术会给患者身体造成一定机械伤害。如果乳腺未形成脓肿，中医治疗不建议使用抗生素，主要通过药食同源的药物外敷内服来改善病症[2]。目前，民间常用乳腺宁搽剂治疗急性乳腺炎，效果显著，其组方药物为木芙蓉叶和穿心莲。木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的干燥叶，气微，味微辛，具有清肺凉血、散热解毒、消肿排脓等功效，归肺、肝经[3]，穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata( Burm.f.)Ness 的干燥地上部分，味苦，性寒，具清热解毒、凉血等功效，归心、肺、大肠、膀胱经[4]。现代药理研究表明，木芙蓉叶及穿心莲均具有显著的抗炎作用[5-6]。

由于抗生素的安全性受到人们关注，从中医传统处方中发掘抗炎作用效果明确、毒副作用小的药物处方具有巨大的开发和利用价值。基于此，本研究借助网络药理学方法系统性分析乳腺宁搽剂治疗急性乳腺炎的药效物质基础及作用机制，以期为乳腺宁搽剂外用新剂型的研发和临床应用提供参考。

1 方法

1.1 活性成分的筛选

在中国知网(http：//www.cnki.net/)查阅与木芙蓉化学成分相关的文献，查找木芙蓉主要化学成分。利用PubChem数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)，确认以上主要化学成分的SDF结构，并将SDF结构导入Swiss ADME(http：//www.swissadme.ch/)网络平台，以胃肠道吸收“high”，药物相似性中两个“yes”为筛选条件，筛选木芙蓉的活性成分。利用TCMSP数据库检索穿心莲的活性成分，设置口服利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18，筛选出穿心莲活性成分。

1.2 活性成分作用靶点及疾病靶点的预测

将获取的活性成分SDF结构式提交到Swiss Target Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平台，预测活性成分的潜在靶点。以“急性乳腺炎”的英文“Acute mastitis”为检索词，在疾病数据库Gene cards (https：/ / www.Gene cards.org/)和OMIM(https：// omim.org/)中检索，合并检索数据并去重后，得到急性乳腺炎相关靶点。

1.3 “活性成分-疾病靶点”网络可视化处理

将活性成分靶点及炎症靶点制作韦恩图，得到活性成分-疾病共同作用靶点基因。将交集靶点映射出相对应的活性成分，建立乳腺宁膏活性成分治疗急性乳腺炎靶点数据库。运用 Cytoscape3.7.2 软件(http：// www.Cytoscape.org/ )绘制网络图，运用网络分析功能进行网络拓扑分析，根据degree值，得到关键活性成分。

1.4 蛋白-蛋白互作网络的构建

将以上基因输入String数据平台(http：//string-db.org)，选择分析的生物体为人类“Homo Sapiens”，将蛋白评分关系设为中等评分0.4，并隐藏出现的游离蛋白，将获取的高置信度蛋白-蛋白互作数据导入Cytoscape3.7.2软件中构建蛋白-蛋白互作网络。根据degree值筛选出核心靶点。

1.5 GO和 KEGG富集分析

通过David网络平台对网络进行GO(gene ontology)注释和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

2 结果

2.1 活性成分的筛选

查阅文献，共获得木芙蓉化学成分73个[7-8]，将获得的化学成分进行ADME筛选，共获取活性成分11个；在TCMSP中共获得穿心莲化学成分24个，去重处理后，乳腺宁活性成分共35个。根据活性成分来源进行重命名，如阿魏酸 Ferulic Acid来源于木芙蓉，重命名为MFR1；大黄素emodin同样来源于木芙蓉，重命名为MFR2，以此类推，见表1。

表1 乳腺宁活性成分

2.2 活性成分作用靶点及疾病靶点的预测

将上述35个活性成分输入Swiss Target Prediction数据库，进行靶点预测，共预测了640个潜在靶点。通过Gene Cards数据库检索到疾病靶点132个，OMIM数据库检索到疾病靶点166个，合并两个数据库检索结果，删除重复值后，共得到296个与急性乳腺炎相关的靶基因，

2.3 “活性成分-疾病靶点”网络可视化处理

绘制乳腺宁活性成分作用靶点与急性乳腺炎相关靶点交集基因韦恩图，得到32个共同靶点，见图1。构建“活性成分-疾病靶点”的可视化处理网络，见图2。网络拓扑学分析结果显示：degree排名前10的活性成分见表2。其中，穿心莲活性成分为8个，木芙蓉为2个。degree越高，表明该节点在网络中的作用越大，由此可知，乳腺宁治疗急性乳腺炎的关键药物主要是穿心莲，关键成分是Andrographin(5-羟基-7，8，2'-三甲氧基黄酮)。

图1 药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点韦恩图Fig.1 The Venn diagram of intersection targets betweenRuxianning and acute mastitis

图2 乳腺宁的“活性成分-疾病靶点”可视化网络Fig.2 Visualization network of active ingredients anddisease targets

成 分degreeAndrographin(CXL18)113-[2-[(1R,4aS,5R,8aS)-5,8a-dimethyl-2-methylene-5-methylol-decalin-1-yl]ethyl]-5H-furan-2-one(CXL14)10Moslosooflavone(CXL6)10Mono-O-methylwightin(CXL5)10Caffeate(MFR4)9Andrographin F(CXL19)914-deoxyandrographolide(CXL17)914-deoxy-12-methoxyandrographolide(CXL9)9oroxylin a(CXL2)9salicylic acid(MFR10)8

在网络中，六边形为药物名和疾病名，菱形为乳腺宁膏活性成分，三角形为靶点，节点之间的边为成分与靶点、疾病与靶点的作用关系。

2.4 蛋白-蛋白互作网络的构建

将32个共同靶点导入STRING数据库，将靶点相互作用评分设置为0.4，隐藏1个游离的靶点，数据库共给出了31个蛋白的相互作用，保存TSV文本数据，导入 cytoscape3.7.2软件绘制蛋白互作网络图，见图3。得到31个靶点，190条蛋白互作的连线，平均度值为11.9，连线粗细与靶点之间关系的紧密度呈正相关。大于平均度值的核心基因有17个，见图4。

图3 PPI 蛋白互作网络图Fig.3 PPI protein interaction network

图4 核心靶点Fig.4 The core targets

2.5 基因功能和通路富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

本研究得到175个GO注释，设置P值<0.05，筛选出140个GO注释，其中，有97个与生物过程(biological process，BP)，26个与分子功能(molecular function，MF)，17个与细胞组分(cellular component，CC)相关。涉及到血管收缩调节、氧化应激反应、炎症反应、脂氧合酶途径、蛋白质磷酸化的正调控等生物过程。分别列举排名前10的生物学过程条目，见图5。

图5 GO功能富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路分析

在30条KEGG通路中，设置P值<0.05，筛选出26条通路，主要涉及癌症信号通路、急性髓系白血病、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等，见图6。

图6 KEGG代谢通路富集分析Fig.6 KEGG metabolic pathway enrichment analysis

3 讨论

本研究结果显示，乳腺宁搽剂组方药物的活性成分有35个，共对应640个作用靶点，其中与急性乳腺炎相关的共同靶点32个。其治疗急性乳腺炎的关键活性成分为5-羟基-7，8，2'-三甲氧基黄酮(Andrographin)和新穿心莲内酯(3-[2-[(1R，4aS，5R，8aS)-5，8a-dimethyl-2-methylene-5-methylol-decalin-1-yl]ethyl]-5H-furan-2-one)。5-羟基-7，8，2'-三甲氧基黄酮为穿心莲中的黄酮类成分[6]。研究表明，穿心莲黄酮通过保护内皮细胞分泌功能抑制炎症反应的发生[9]。新穿心莲内酯，又名穿心莲丙素，被誉为治疗肺部疾病、肝炎和炎症性皮肤病的下一代天然抗炎药[10]。现代研究表明，新穿心莲内酯能显著抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞增殖及NO释放[11]，具有抗炎活性及免疫刺激活性[12]。通过PPI发现，乳腺宁治疗急性乳腺炎各靶点间密切作用主要与白蛋白ALB、表皮生长因子受体EGFR、蛋白激酶AKT1、白细胞介素1β、髓过氧化物酶MPO等蛋白相关。其中，ALB的渗出是炎症反应最重要的特征，ALB能结合和转运各种生理物质与毒性物质，从而发挥抗炎作用；AKT1、EGFR能参与细胞增殖，分化和凋亡等多种细胞活动；炎症发生时，MPO的活性增强，摄中性粒细胞的数量越多；IL1B是炎症反应的重要介质，能够调节摄中性粒细胞的渗出，造成乳腺组织的损伤，IL1B激活NF-κB信号通路，促进炎症的发生。

富集分析显示，乳腺宁有效成分靶点主要通过炎症反应正调节(positive regulation of inflammatory response)、一氧化氮生物合成过程正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、肽基酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)等生物学功能；癌症信号通路(Pathways in cancer Acute)、急性髓系白血病(myeloid leukemia)、NF-κB信号通路( NF-kappa B signaling pathway)等信号通路，发挥治疗急性乳腺炎的作用。

综上所述，乳腺宁中的穿心莲黄酮等主要活性成分可能通过癌症、急性髓系白血病、NF-κB信号通路等信号通路作用于ALB、EGFR、MPO、IL1B、AKT1等关键靶点，发挥酶活性、生物受体活性等生物学作用，从而达到治疗急性乳腺炎作用。本研究分析了乳腺宁搽剂治疗急性乳腺炎的药效物质基础及作用机制，为乳腺宁外用新剂型的研发提供了有价值的参考。