CrxV 对水稻白叶枯病菌致病力的调控

林玉暖，候运郁，米 多，李春霞，陶 均

（1.海南大学 生命科学与药学院;2.海南大学 热带作物学院,海口 570228）

环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌中普遍存在的第二信使分子，首次在葡糖酸醋酸杆菌中被发现，是纤维素合酶的异构激活因子[1-2]。其后的研究结果表明，c-di-GMP 参与调节各种生物过程如致病性、运动性、生物被膜、胞外多糖及胞外酶等[3-4]。胞内c-di-GMP 水平受含有GGDEF、EAL 或HD-GYP 结构域蛋白的调控：GGDEF 蛋白负责c-di-GMP 合成，而EAL 或HD-GYP 蛋白参与c-di-GMP 的分解[5]。GGDEF 结构域含有约180 个氨基酸残基，具有保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe 氨基酸残基序列[6]。在新月形杆菌（Caulobacter crescentus）中，GGDEF 结构域蛋白PleD 具有双鸟苷酸环化酶活性，调控细菌的运动功能，促进细胞从运动转向静止[7-9]。EAL 结构域长约250 个氨基酸，Glu-Ala-Leu 序列高度保守，可调控细菌生物被膜的形成和运动性[10]。有时GGDEF 和EAL 结构域共存于同一个蛋白中，可能只有其中1 个结构域有功能。例如，铜绿假单胞菌BifA 含有GGDEF 和EAL 结构域，但其没有c-di-GMP 合成却有分解活性[5]。稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）是引起水稻白叶枯病的病原菌[11]，可对水稻造成严重的产量损失。C-di-GMP 代谢相关蛋白同样参与Xoo 致病力的调控，如：①GGDEF 结构域蛋白GdpX1 具有合成c-di-GMP 的活性，调节Xoo的运动能力、胞外多糖的含量以及致病力[12]；② EAL 结构域蛋白PXO_03877 具有降解c-di-GMP 的活性，增强细菌的致病性、运动性、胞外多糖合成以及生物被膜的形成能力[13]；③GGDEF/EAL 结构域蛋白PdeR 与组氨酸激酶PdeK 组成双组份系统，磷酸化的PdeR 具有分解c-di-GMP 的能力，pdeR突变降低Xoo 的致病性、胞外多糖及生物被膜的含量，但对运动性和胞外酶无明显影响[14]。本研究分析了Xoo 中另一个GGDEF/EAL 结构域蛋白CrxV 对运动性、生物被膜、胞外多糖以及胞外酶等毒力因子的调控作用，为进一步分析c-di-GMP 在Xoo 与水稻互作中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料Xoo野生型菌株PXO99A、大肠杆菌DH5a、基因敲除载体pK18mobSacB、过表达载体菌株pHM1 等均由笔者所在的实验室保存；一般化学药品购自广州化学试剂公司；PCR 试剂购自诺唯赞生物科技有限公司；内切酶和连接酶购自NEB 生物科技有限公司；快速质粒小提试剂盒、琼脂凝胶DNA 回收试剂盒等购自天根生物科技有限公司；IR24 水稻用于检测Xoo的致病力；用SMART 软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守结构域。

1.2 突变体与互补菌株的构建及其致病力分析将crxV基因上下游各约500 bp 的序列通过PCR 扩增、酶切（HindIII/XbaI 与XbaI/EcoRI）回收后连接到自杀性载体pK18mobSacB（HindIII/EcoRI 酶切），获得敲除载体pK-crxV，电击转化PXO99A菌株，采用同源重组2 次交换的方法构建突变体ΔcrxV[15-16]。利用PCR 方法扩增crxV基因片段，酶切（HindIII/EcoRI）回收后连接互补载体pHM1（HindIII/EcoRI 酶切），然后转化ΔcrxV获得互补菌株C-ΔcrxV（引物序列见表1）。为便于比较，野生型菌株和ΔcrxV也转入空载体pHM1。采用剪叶法检测致病力，将突变体菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株PXO99A-pHM1 和互补菌株C-ΔcrxV接种至生长期为60 d 的水稻叶片上，14 d 后统计水稻的发病情况。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 胞外酶活性检测参照文献[17]的方法检测胞外酶的活性，将突变体菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株PXO99A-pHM1 和互补菌株C-ΔcrxV置28 ℃条件下液体培养48 h 后，取1 mL 培养物用ddH2O 洗涤2 遍，用1 mL ddH2O 重悬菌体。取3 μL 重悬液分别接种至纤维素检测培养基、淀粉酶检测培养基和蛋白酶检测培养基上，在28 ℃条件下静置培养5 d。PGA 培养基：1 g·mL-1Tryptone、1 g·mL-1葡萄糖、0.1 g·mL-1L-谷氨酸钠、1.5% agar；纤维素检测培养基为PGA 培养基+0.5%羧甲基纤维素；淀粉酶检测培养基为PGA 培养基+0.1%可溶性淀粉；蛋白酶检测培养基为PGA 培养基+2%脱脂奶粉。纤维素酶活性测定方法：0.1%刚果红染色30 min，用1mol·L-1的NaCl 溶液洗2 次，观察酶水解直径(cm)；淀粉酶活性测定方法：1：100 I2/KI (0.08% mol·L-1I2，3.2 mol·L-1KI)溶液染色10 min，观察酶水解直径（cm）；蛋白酶活性测定方法：直接在蛋白培养基上观察水解光圈（cm）。每个试验重复3 次。

1.4 游动性检测 参照文献[18]的方法检测游动性。用牙签蘸取1.3 节中的菌重悬液，垂直接种于含0.25%琼脂的游动性培养基（0.03%Tryptone,0.03%Yeast-extract,0.25%agar）底部，在28 ℃条件下静置培养4 d，测量菌株在培养基表面游动的直径（cm）并统计。重复3 次。

1.5 生物被膜及胞外多糖试验参照文献[19 -20]的方法检测生物被膜的形成及胞外多糖的产生。取单克隆细菌在PSA 中培养48 h 后，取2 mL 菌在5 500 r·min-1条件下离心3 min，收集菌体，用M210 培养基（5 g·L-1蔗糖；8 g·L-1酶水解酪素；4 g·L-1Yeast-extract；3 g·L-1K2HPO4；0.3 g·L-1MgSO4· 7H2O，pH7.0）洗涤2 次，再加入M210 重悬，把重悬液的OD600调至0.5。生物被膜实验：取2 mL 重悬液（OD600=0.5）接种至玻璃试管，在28 ℃下静置培养4 d，缓慢倒出玻璃试管底的培养基，用H2O 洗涤3 遍，0.1%结晶紫染色液染色30 min，再用H2O 洗涤3 遍，加入3 mL90%乙醇溶解，在OD590下测吸光值。胞外多糖实验：取2 μL 重悬液（OD600=0.5）接种至PGA 培养基表面，在28 ℃下静置培养4 d，观察菌落表面形态。试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 CrxV 保守结构域的预测结果根据SMART 预测结果，CrxV 含有GGDEF、EAL、HAMP 结构域(图1)。GGDEF 和EAL 可能参与c-di-GMP 的合成与分解，而HAMP 可能通过调控CrxV 的二聚体化影响GGDEF 和EAL 的活性，因此，CrxV 可能参与c-di-GMP 的代谢，调控细菌对外界环境的响应能力。

图1 CrxV 的保守结构域保守结构域预测采用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)；GGDEF：c-di-GMP 合成结构域；EAL：c-di-GMP 分解结构域；HAMP：CrxV 二聚化结构域。Fig.1 The conserved domains of CrxVCrxV conserved domains,analyzed by SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) with default parameters.GGDEF：The domain involved in c-di-GMP synthesis,EAL：The domain involved in c-di-GMP degradation,HAMP：The protein dimerization domain;Blue box:Transmembrane helix;Pink box:low complexity regions.

2.2 crxV 突变体的成功构建为了分析crxV的功能，本实验采用同源重组2 次交换法构建了crxV的缺失突变体（图2）。结果显示：crxV突变体基因组扩增产物约为1 000 bp，而野生型PXO99A基因组扩增片段比突变体长约1 500 bp（与crxV基因大小一致），说明crxV突变体构建成功。

图2 PCR 验证 crxV 突变体（ΔcrxV）M：DL2000 Marker；1、2：ΔcrxV；W：野生型 PXO99A；N：阴性对照Fig.2 PCR confirmation of the crxV mutantM:DL2000 Marker;lanes 1 and 2:ΔcrxV；W:wild-type PXO99A；N:negative control.

2.3 crxV 突变与Xoo 致病性的关系为了分析基因对Xoo的致病性，本实验构建了ΔcrxV的互补菌株C-ΔcrxV。致病性分析结果发现，ΔcrxV的病斑长度比野生型PXO99A的病斑长度减短了3 cm 左右，互补菌株的致病力与野生型基本一致（图3）。说明CrxV 是Xoo 侵染所必需的。

图3 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的致病性分析A：接种水稻14 d 后，野生型菌株PXO99A-pHM1、突变体菌株ΔcrxV-pHM1 和互补菌株C-ΔcrxV 的病斑特征，H2O 为空白对照。B：接种14 d 后的水稻病斑长度/cm (*:P<0.05,**:P<0.01)。Fig.3 Virulence analysis of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:The lesions caused by PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV (H2O:mock control).B:The lesion lengths (cm) of the infected IR24 leaves after 14 days’ inoculation of the indicated Xoo strains (*:P<0.05,**:P<0.01,compared withPXO99ApHM1).

2.4 crxV 突变与Xoo 运动性的关系运动性是Xoo的重要毒力因子之一，且受c-di-GMP 调控[21]，为此有必要分析crxV突变是否影响Xoo的运动能力。PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV的游动能力分析结果（图4）表明，这3 个菌株之间泳动能力没有显著差异，说明CrxV不调控Xoo 的运动性。

图4 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的 游 动能力上图：细菌在平板上的游动表型；下图：游动直径的统计分析。Fig.4 The swimming abilities of PXO99A-pHM1,ΔcrxVpHM1 and C-ΔcrxVUp panel:swimming phenotypes of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV;Down panel:the diameters of swimming zones of the indicated strains.All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.

2.5 crxV 突变与Xoo 生物被膜形成的关系胞外多糖和生物被膜是Xoo的毒力因子，与细菌的致病性密切相关[14]。为分析胞外多糖的产生和生物被膜的形成，本实验将菌株接种至PGA 固体培养基表面和M210 液体培养基中，静置培养4 d 后发现，PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV菌落表面无明显差别，而ΔcrxV-pHM1 的生物被膜形成的量比PXO99A-pHM1 高出了2 倍，回补菌株与野生型菌株的生物被膜形成量接近一样（图5），说明CrxV 负调控Xoo生物被膜的形成，但可能不调控细菌胞外多糖的产生。

图5 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 产生生物被膜（A）及胞外多糖（B）的能力A：液体静置培养4 d 后生物被膜含量分析。上图：气液表面生物被膜的结晶紫染色；下图：生物膜含量的定量分析（*:P<0.05）。B：PGA 固体培养基上菌落的生长情况及表型特征。Fig.5 The biofilm (A) and extracellular polysaccharide (B)contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and CΔcrxVA:The biofilm contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV 4 days after incubation (*:p<0.05).Up panel:the crystal violet staining biofilm synthesized in the liquid-gas interfaces;Down panel:the biofilm contents of the indicated strains (OD590).All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.*:P <0.05,compared withPXO99A-pHM1.B:The colony phenotypes (4 days after incubation) of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV.

2.6 crxV 突变与Xoo 胞外酶活性的关系胞外酶通过Ⅱ型分泌系统将毒力因子分泌至胞外，促进细菌对寄主的致病力，胞外酶合成或分泌可能受c-di-GMP 调控[22-23]。如图6 所示，PXO99A-pHM1、ΔcrxVpHM1 和C-ΔcrxV菌株间的胞外纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶活性均没有显著差别，说明CrxV 不调控Xoo 胞外酶的合成或分泌。

图6 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 胞外酶活性分析A：蛋白酶活性；B：淀粉酶活性；C：纤维素酶活性。1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV。Fig.6 The extracellular enzyme activities of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:protease activities;B:amylase activities;C:cellulase activities.1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV.All the experiments were repeated triple times with same results.

3 讨论

C-di-GMP 分别由GGDEF 结构域蛋白负责合成和EAL/HD-GYP 结构域蛋白负责降解，胞内受体通过感知c-di-GMP 水平调控细胞多个代谢途径，影响细菌的生长及环境适应能力。通常低水平的c-di-GMP 提高细菌的运动能力，高水平的c-di-GMP 则有利于生物被膜的形成，调节细菌的致病能力[4]。在Xoo 中，GGEDF 结构域蛋白GdpX1，通过负调控胞外多糖的产生和运动性从而抑制Xoo 的致病性[12]。EAL 结构域蛋白PXO_03877 具有c-di-GMP 水解酶活性，正调控致病性、生物膜的形成和胞外多糖的产生[13]。PdeR 含有保守的GGDEF 和EAL 结构域，作为响应调节因子与组氨酸激酶PdeK 组成双组份系统，正调控Xoo致病性和胞外多糖的产生[24]。同PdeR 类似，CrxV 也含有保守的GGDEF 和EAL 结构域，但其具体工作还不清楚。由于致病性与c-di-GMP 的含量可能成负相关[13,24],crxV突变导致Xoo 致病力降低，因此CrxV 可能作为c-di-GMP 分解酶，其GGDEF 结构域可能没有酶活性。虽然研究发现Xoo 中影响致病性的c-di-GMP 代谢酶都可能调控诸如运动性、胞外多糖和胞外酶等毒力因子的合成或分泌[13,24]，但crxV突变并不影响这些因子的形成或分泌。有趣的是，crxV突变导致Xoo 生物被膜含量显著增加。生物被膜形成和解聚是细菌致病重要的调节过程，缺一不可。因此，CrxV 可能负调控生物被膜的解聚，进而正调控病原菌的致病力。以上结果虽然显示CrxV 可能通过介导c-di-GMP 代谢，影响病原菌生物被膜的含量，调控病原菌的致病力，但CrxV 的酶活性及其在生物被膜形成与解聚中的作用还不清楚，尚需做进一步研究。