保育期仔猪盲肠微生物菌群多样性分析

田博雅，马亿珈，奚梦瑶，路 畅，杨 阳，蔡春波，赵 燕，高鹏飞

（山西农业大学动物科学学院 030801）

肠道微生物是指动物肠道中存在的数量庞大，种类繁多，功能多样的微生物，其有利于维持宿主肠道微生态平衡，在营养物质的消化吸收中起着关键作用[1-2]。它们大部分与机体细胞密切接触，交换能量物质，传递信息。Filippo等人的研究发现宿主饮食习惯会对肠道微生物菌群的组成产生深远影响[3]。左斌等人在探讨影响仔猪肠道微生物早期定植的因素的研究中发现，仔猪生命早期建立良好的肠道菌群不仅有利于仔猪前期的健康生长，而且对后期的生长育肥也具有重要影响[4]。这些年来，越来越多的研究表明肠道菌群与宿主健康之间存在密切联系。颜桂花等人的研究发现，在仔猪日粮中添加可溶性玉米纤维可以改变仔猪盲肠内微生物多样性，从而提高盲肠内有机酸浓度，降低肠道渗透性，改善仔猪肠道健康[5]。丁酸梭菌作为一种新型的抗生素替代品，可以促进仔猪肠道的生长发育和消化吸收，提高肠道中有益菌群的数量和肠道的屏障功能[6,7]。

仔猪肠道健康对于自身后期生产性能的发挥至关重要。本试验以山西省地方优势猪种马身猪、大白猪、山西黑猪和晋汾白猪为研究对象，采用16s测序技术对仔猪阶段盲肠微生物多样性进行检测，分析不同猪品种盲肠微生物特性，拟探寻仔猪保育期盲肠微生物的变化规律，为仔猪保育提供理论参考。

1 材料与分析

1.1 试验动物与样品采集

按照行业饲养标准，统一将试验动物饲养于大同市（中国山西省）种猪场，试验动物组建时选择日龄一致，体重相近的马身猪、山西黑猪、大白猪和晋汾白猪四个品种的仔猪进行试验。在仔猪断奶末期（28d）和保育末期（70d）进行屠宰，每个品种仔猪各取3头，屠宰前禁食8h，但可自由饮水，采集盲肠段的内容物置于冻存管于液氮中保存，每个采样点的样品随机抽取3份进性16S rRNA测序分析。

1.2 样本DNA抽提与16S rRNA测序

肠道内容物DNA的提取采用北京天根生物科技有限公司产品DNA提取试剂盒进行，并检测其DNA纯度，浓度及质量。根据细菌V 3-V 4可变区进行引物设计，引物序列：341 F（5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´）和806 R（5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´）,进行PCR扩增。扩增程序：95 ℃预变形3 min；27个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s）；最后72℃延伸10 min。PCR产物QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测。样品在上海美吉生物医药科技有限公司Miseq PE 300平台进行检测。序列数据根据PE reads之间的重叠关系，使用FLASH软件进行拼接，采用Trimmomatic软件对拼接质量进行质控过滤及数据优化。

1.3 OTU菌群聚类分析

对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，然后去除没有重复的单序列，而后再按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，最后对所得OTU进行不同分类学水平的注释，生成OTU分析结果。使用97%相似度的OTU，利用Mothur做Rarefaction分析，利用R Studio（v.3.0.2）工具制作Shannon和Chao指数上的稀释曲线图。

1.4 菌群多样性分析

利用R语言工具做出不同分组在门和属水平上的群落丰度组成图（群落Bar图）。采用Mothur（v.1.34.0）软件进行菌群Alpha多样性分析，计算不同随机抽样下微生物群落的多样性和丰富度，分别选择Sobs指数，Heip指数指数和Simpson指数进行分析。采用PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐标分析，用来研究样本群落组成的相似性或差异性。利用R语言对一系列特征值和特征向量进行排序，然后选择排在前几位的最主要特征值，最后将其表现在坐标系里。

1.5 数据统计分析

使用Excel软件对OTU数据进行基础分析处理，同一品种不同日龄间采用T检验分析，不同品种同一日龄间采用单因素方差分析，选用SSR法进行组间比较，0.05和0.01为显著水平。

2 结果

2.1 OTU聚类分析

16S rRNA测序结果经过滤质控之后获得了648216条序列，共获得888个OTU，每个样品平均获得393个OTU。

2.2 稀释曲线分析

利用Mothur做Rarefaction分析后得到稀释曲线，图 1中分别呈现了Shannon和Chao指数稀释曲线，可见稀释曲线均达到了平台期，包含了样本中绝大多数微生物多样性的样本信息，说明试验数据符合条件。

图1 稀释曲线分析结果

2.3 Alpha多样性分析

Sobs指数可以用来描述群落丰富度的实际观测值。由Sobs指数图（图 2A）可知，在28日龄时，大白猪盲肠肠道微生物丰富度最高，马身猪最低；在70日龄时，大白猪盲肠肠道微生物丰富度最高，晋汾白猪最低。在整个保育期，大白猪的盲肠肠道微生物丰富度都是最高的。随着仔猪生长发育，大白猪，晋汾白猪和山西黑猪的盲肠肠道微生物丰富度逐渐降低，而马身猪逐渐升高。

Heip指数是用来描述Heip群落均匀度的指数。由Heip指数图（图 2B）可知，在28日龄时，晋汾白猪盲肠肠道微生物均匀度最差，其他三个品种较为一致；在70日龄与28日龄相反，大白猪盲肠肠道微生物均匀度最差，山西黑猪和晋汾白猪次之，马身猪最低。随着仔猪生长发育菌群均匀度均发生显著变化，马身猪均匀度升高但变化不显著，而大白猪变化最大，菌群发生较大变化。

Simpson指数是用来估算样本中微生物多样性的指数，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。由Simpson指数图（图 2C）可知，在28日龄时，晋汾白猪盲肠微生物多样性最高，马身猪最低；在70日龄时，马身猪盲肠微生物多样性最高，大白猪最低。随着仔猪生长发育，大白猪，晋汾白猪和山西黑猪的盲肠微生物多样性逐渐降低，而马身猪逐渐升高。

图2 Sobs指数图(A) Heip指数图(B) Simpson指数图(C)

Alpha多样性结果分析发现，Sobs和Simpson指数的变化趋势基本一致，大白猪，晋汾白猪和山西黑猪随着日龄增长逐渐降低，马身猪逐渐升高。而在Heip指数中，随着日龄增长，大白猪，晋汾白猪和马身猪逐渐降低，山西黑猪逐渐上升。

2.4 Beta多样性分析

PCoA分析是一种对数据进行简化分析的技术，可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，用来研究样本群落组成的相似性和差异性。基于加权UniFrac距离进行的PCoA分析的结果，在属水平分析发现，大白猪仔猪的盲肠微生物菌群在保育期（28～70日龄）较为集中，而其余品种仔猪的盲肠微生物菌群分布在不同区域。在相同的日龄上，不同品种样本都能完全区分，差异很显著（图 3）。在28日龄时，四个品种样本都处于一、三象限；而在70日龄时，不同品种之间分布比较分散，一、三、四象限都有，差异比较显著。

图3 PCoA分析图

X轴和Y轴表示两个选定的主坐标轴；X轴和Y轴的刻度是相对距离，无实际意义；不同颜色或形状的点代表不同分组的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。

2.5 群落组成分析

分类学分析结果表明，微生物菌群分布于17个门（图4），四个品种的盲肠肠道微生物优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes），其中70日龄的晋汾白猪和28日龄的马身猪中微生物群落丰度仅次于厚壁菌门的是变形菌门（Proteobacteria），所占比例分别为32.9%和19.6%；其余分组中微生物群落丰度仅次于厚壁菌门的是拟杆菌门（Bacteroidetes)。随着日龄增加，大白猪和山西黑猪仔猪盲肠中的厚壁菌门丰度呈逐渐升高的趋势，而晋汾白猪和马身猪仔猪盲肠中的厚壁菌门均是呈逐渐降低的趋势。晋汾白猪仔猪在28日龄时盲肠中的厚壁菌门所占比重为73.3%，显著高于（P＜0.05）其他相同日龄的品种。山西黑猪仔猪在28日龄时盲肠中的厚壁菌门的占比最少，为26.8%，而在70日龄时，山西黑猪仔猪盲肠中厚壁菌门所占比例显著高于其他品种，为70.3%，并且拟杆菌门在山西黑猪仔猪保育期所占的比例下降最为迅速，从69.4%降到6.7%。马身猪仔猪的盲肠中拟杆菌门所占的比例是随着仔猪的生长发育逐渐升高，而在大白猪、山西黑猪和晋汾白猪中都是随着仔猪生长发育逐渐降低。

图4 门水平上样本的群落丰度组成图

进一步分析17个门中包含的257个属（图 5）。在菌属水平分析发现，乳酸杆菌属（Lactobacillus）、普雷沃氏菌属（Prevotellaceae_NK3B31_group）、大肠志贺氏杆菌属（Escherichia_Sh-igella），狭义梭状芽孢杆菌属（Clostrid-ium sensu stricto 1）为所有分组中的优势菌属，在马身猪保育期盲肠微生物中这四种菌属所占比例分别为13.2%，7.1%，9.6%，1.7%；在山西黑猪中所占比例分别为1.6%，4.6%，6.2%，4.0%；在大白猪中所占比例分别为0.9%，16.9%，5.6%，4.1%；在晋汾白猪中所占比列分别为16.8%，1.9%，9.6%，9.3%。马身猪在28日龄的优势菌属为大肠志贺氏杆菌属，在70日龄的优势菌属为乳酸杆菌属；山西黑猪在28日龄的优势菌属为拟杆菌属（Bacteroiders），在70日龄的优势菌属为Subdoligranulum；晋汾白猪在28日龄的优势菌属为乳酸杆菌属，在70日龄的优势菌属为拟杆菌属；大白猪在28日龄和70日龄的优势菌属都为普雷沃氏菌属。随着仔猪生长发育，在保育前期乳酸菌比例较高，在保育后期普雷沃氏菌属丰度逐渐升高。

图5 属水平上样本的群落丰度组成图

3 讨论

仔猪的健康生长需要一个平衡的肠道微生态环境。新生仔猪从母体及分娩环境中获得胃肠道菌群并以此形成较为稳定的微生态环境。健康的肠道菌群具有促进猪的营养代谢，调节免疫应答，抑制病原感染等功能[8,9]。本研究结果表明，马身猪、山西黑猪和大白猪在保育期（28～70d）肠道微生物多样性虽然处于一个动态变化范围，但差异不显著（P ＞ 0.05）。而晋汾白猪仔猪在保育期的微生物多样性发生较大变化（P＜ 0.05），说明不同品种间肠道微生物的发展与成熟有着显著的差异。随着日龄增长，马身猪的盲肠肠道微生物多样性逐渐升高但变化范围不大，山西黑猪、晋汾白猪和大白猪品种不同时间点丰度范围变化较大，而且大白猪变化最大，说明我国地方猪品种肠道微生物较为稳定，推测可能与马身猪较高的抗逆性能有关。

研究表明肠道变形菌门能够反映微生态失调或不稳定，在某些肠道环境下，他们会成为可引发炎症的肠道微生物，动物易出现代谢疾病和生殖障碍[10]。本研究发现70日龄的晋汾白猪肠道内变形菌门的数量显著上升，而其他品种中变形菌门的丰度并不高，提示应该加强对晋汾白猪仔猪保育工作，保证仔猪肠道健康。拟杆菌为革兰氏阴性菌，是形态一致或多形态的专性厌氧杆菌，与其他菌群及宿主之间有着复杂的联系，是条件致病菌，与宿主健康有着紧密的联系[11]。

近年来普雷沃氏菌属获得了越来越多的关注，因为他能够降解广谱的植物多糖[12]，周波兰等人的研究表明普雷沃氏菌属丰度升高会促进肠道消化碳水化合物和膳食纤维，从而有利于维持肠道菌群稳定，增强免疫功能[13]。普雷沃氏菌属还可以分解引发肠道疼痛的黏肠液。而本试验中晋汾白猪在整个保育期内普雷沃氏菌属的丰度处于较高水平，说明其对碳水化合物的消化能力强。

4 结论

本研究对马身猪、山西黑猪、大白猪和晋汾白猪四个品种的仔猪保育阶段肠道微生物多样性进行分析，发现不同品种仔猪的盲肠微生物多样性具有一定显著差异。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是此阶段的优势菌门，乳酸杆菌在保育前期处于较高水平，普雷沃氏菌属在保育后期丰度逐渐升高。本研究结果可为探析肠道微生态对仔猪生长发育的作用机制提供参考。