紫苏提取物对裂壶藻油氧化稳定性的影响

林荣芳 高丽伟 徐梦豪 赵祥忠

(齐鲁工业大学〔山东省科学院〕食品科学与工程学院，山东 济南 250353)

裂壶藻(Schizochytrium)，属网黏菌纲破囊壶菌目破囊壶菌科，单细胞藻类海洋微生物[1]。裂壶藻油是裂壶藻的主要合成产物，含丰富的二十二碳六烯酸(DHA)。DHA能够抑制炎症，降低心血管疾病、高血压等的患病风险[2-4]，促进大脑和视网膜的发育[5]。裂壶藻油富含多不饱和脂肪酸(PUFAs)，对贮藏条件敏感，极易发生氧化酸败，而降低功效[6]。为了提高其氧化稳定性，需在藻油中添加2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)、2-叔丁基对苯二酚(TBHQ)等合成抗氧化剂，但合成抗氧化剂对人体内脏器官有一定的毒副作用，长期食用会对人体产生一定的危害性[7]。近年来，有关紫苏、迷迭香、辣椒等香辛料中的天然抗氧化成分的研究较多且成果显著[8]。

紫苏(Perillafrutescens)别名赤苏、香苏、黑苏等，为唇形科紫苏属一年生草本植物[9]，含有丰富的迷迭香酸、阿魏酸等多酚以及黄酮类化合物，具有抗氧化、抗衰老、抑菌、消炎等功能活性[10-13]。王亚平[14]研究发现，紫苏提取物对花生油和猪油的氧化稳定起到非常好的效果，可有效抑制油脂的氧化酸败。胡晓丹等[15]研究表明，0.09%的紫苏醇提物对油脂具有较高的抗氧化活性。朱元龙[16]研究显示，紫苏叶提取物对花生油的抗氧化效果优于大豆油，且紫苏叶提取物的抗氧化作用强于维生素E和BHT。文章拟通过裂壶藻油强制氧化试验，以过氧化值、丙二醛值、茴香胺值、共轭二烯值作为评价指标，比较紫苏提取物在裂壶藻油中的抗氧化效果，为紫苏提取物用作藻油的天然抗氧化剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏提取物：多酚、黄酮含量分别为40，27 mg/g，汇林生物制品有限公司；

裂壶藻油(未添加任何抗氧化剂)：青岛琅玡台集团股份有限公司；

TBHQ：纯度≥99.0%，上海蓝平实业有限公司；

茶多酚：纯度≥99.0%，郑州康源化工产品有限公司；

硫酸：分析纯，烟台远东精细化工有限公司；

异辛烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

对氨基苯甲醚：分析纯，山东旭晨化工科技有限公司；

甲醇：色谱级，上海星可高纯溶剂有限公司；

正己烷：色谱级，常州市傲华化工有限公司；

无水硫酸钠：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

MDA试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计：UV-9000型，上海元析仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH型，常州国宇仪器制造有限公司；

台式高速离心机：TG16-WS型，湘仪离心机仪器有限公司；

旋涡混匀器：XW-80A型，上海驰唐电子有限公司；

超声波清洗器：KQ5200E型，昆山市超声仪器有限公司；

万分之一天平：FA1004型，上海上平仪器有限公司；

电热鼓风干燥箱：BPG-9056A型，上海一恒科学仪器有限公司；

气相色谱—质谱联用仪：Aglient 7890B GC-5977B MSD型，美国安捷伦公司；

旋转蒸发器：RE-2000A型，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 紫苏提取物对裂壶藻油氧化稳定性的影响 紫苏提取物以多酚含量进行换算，最大添加量为0.1%，将紫苏提取物添加量设置为0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，以未添加紫苏提取物的裂壶藻油为空白组，于60 ℃烘箱中进行周期为15 d的强制氧化，每24 h搅拌均匀，并且任意交换位置。每3 d进行取样，检测藻油的过氧化值、丙二醛值、共轭二烯值、茴香胺值，强制氧化结束后对藻油进行脂肪酸检测。

1.3.2 抗氧化剂对裂壶藻油氧化稳定性的影响 根据GB 2760—2014，茶多酚、TBHQ最大添加量分别为0.04%，0.02%，且为抗氧化效果最佳剂量[17-19]，与紫苏提取物最佳剂量进行比较。以未添加抗氧化剂的裂壶藻油为空白组。其中，由于茶多酚不溶于油脂，参照欧阳梦云等[20]的方法并修改：准确称取一定量的茶多酚溶于6 mL 乙醇，加入60 g裂壶藻油，混匀，利用旋转蒸发仪减压蒸馏，制备高浓度的含茶多酚裂壶藻油。

1.3.3 理化指标检测

(1)过氧化值：参照GB 5009.227—2016。

(2)丙二醛值：参照MDA测定试剂盒说明书。

(3)共轭二烯值：参照丁俭等[21]的方法。

(4)茴香胺值：参照GB/T 24304—2009。

1.3.4 脂肪酸组成分析

(1)样品甲酯化处理：参照刘静[22]的方法并修改。将0.30 g藻油置于具塞试管中，加入5 mL正己烷进行溶解，加入5 mL体积分数为5%的硫酸—甲醇溶液，50 ℃恒温水浴2 h，冷却，加入4 mL正己烷，充分混匀，静止10 min，取上清液，加入少量无水硫酸钠，过0.22 μm滤膜。

(2)气相色谱—质谱分析：色谱柱为TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，进样量1 μL；载气为高纯氦气，流量1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序：60 ℃ 保持1.5 min，以30 ℃/min升温至120 ℃，以1.5 ℃/min 升温至250 ℃，保持1.5 min。质谱条件：EI离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，接口温度250 ℃。利用仪器配置的NIST 14标准质谱数据库对藻油样品进行定性分析，按照峰面积归一法计算藻油样品中各组分的相对含量。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 21软件进行数据统计分析，采用Origin 2017软件绘图，结果表示为平均值±SD。P<0.05表示差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 紫苏提取物对裂壶藻油氧化稳定性的影响

2.1.1 过氧化值 由图1可知，强制氧化期间，各剂量组裂壶藻油中的过氧化值均因氧化时间的延长而增加，空白组的过氧化值变化最大。各剂量组的紫苏提取物均对裂壶藻油过氧化值的增加起到抑制作用，与低剂量的紫苏提取物相比，高剂量组的紫苏提取物在各时间点的抑制过氧化效果更佳，呈一定的剂量效应。与空白组相比，强制氧化第15天，添加0.10%紫苏提取物的裂壶藻油组的过氧化值显著降低49.97%(P<0.01)。由于紫苏提取物中酚类物质含量较高，且含有多种黄酮类化合物，如黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类物质[23]，能够有效清除自由基，抑制油脂过氧化反应，延缓裂壶藻油的初级氧化，减少初级氧化产物的产生。

图1 紫苏提取物对裂壶藻油过氧化值的影响Figure 1 The effect of different doses of perilla extract on the peroxide value of Schizochytrium oil

2.1.2 丙二醛值 裂壶藻油的初级氧化产物(ROOH)不稳定，极易分解形成丙二醛等次级氧化产物，损害油脂的品质，通过丙二醛含量反映油脂氧化程度[24]。由图2可知，各组裂壶藻油中丙二醛值随氧化时间的延长不断增加，强制氧化0～6 d，各剂量组间丙二醛值的差异不明显。强制氧化试验结束后，与空白组相比，各剂量组裂壶藻油中丙二醛含量均显著降低(P<0.01)。0.10%，0.08%紫苏提取物剂量组相比其他剂量组对丙二醛的抑制作用更加明显，0.01%剂量组同比0.08%剂量组丙二醛值下降14.47%。综上，紫苏提取物可显著抑制裂壶藻油的氧化，减少裂壶藻油初级氧化产物的产生，试验所考察的紫苏提取物剂量范围均能有效地抑制裂壶藻油初级氧化产物分解生成丙二醛。

2.1.3 茴香胺值 油脂的氧化伴随着大量初级氧化产物的产生，氢过氧化物在氧化过程中会分解生成醛、酮、酸等次级氧化产物，这些产物通常会导致油脂产生令人不愉快的气味[25]。由图3可知，随着氧化时间的延长，各组裂壶藻油中p-茴香胺值均增加；裂壶藻油中次级氧化产物开始增多，强制氧化第6天，空白组相比于其他剂量组p-茴香胺值开始显著性增加(P<0.05)。与空白组相比，各剂量组由于紫苏提取物的添加抑制了裂壶藻油的氧化，油脂中次级氧化产物减少，p-茴香胺值增加趋势明显降低。强制氧化第15天，0.10%紫苏提取物剂量组的p-茴香胺值为51.88，相比空白组降低了33.02%，是各剂量组中p-茴香胺值下降趋势最显著的一组。

图2 紫苏提取物对裂壶藻油丙二醛值的影响Figure 2 The effect of different doses of perilla extract on the malondialdehyde value of Schizochytrium oil

2.1.4 共轭二烯值 裂壶藻油因氧化会产生大量的氢过氧化合物，其中不饱和脂肪酸的双键进行重组，形成共轭二烯。由图4可知，各组裂壶藻油的共轭二烯值均随氧化时间的延长而增加，强制氧化6 d后，空白组的共轭二烯值增长趋势明显高于其他组。随着紫苏提取物添加剂量的增加，裂壶藻油中共轭二烯值的增加趋势明显减缓。强制氧化第15天，0.10%紫苏提取物剂量组的共轭二烯值为27.79，相比空白组降低了47.23%；同比其他剂量组，裂壶藻油中添加0.10%的紫苏提取物对抑制共轭二烯生成的效果更佳。

图3 紫苏提取物对裂壶藻油茴香胺值的影响Figure 3 The effect of different doses of perilla extract on the anisidine value of Schizochytrium oil

图4 紫苏提取物对裂壶藻油共轭二烯值的影响Figure 4 The effect of different doses of perilla powder on the conjugated diene value of Schizochytrium oil

2.2 抗氧化剂对裂壶藻油氧化稳定性的影响

2.2.1 过氧化值 由图5可知，添加0.10%紫苏提取物、0.04%茶多酚、0.02% TBHQ的裂壶藻油的过氧化值均显著低于空白组(P<0.05)。强制氧化6 d后，空白组的过氧化值增加趋势明显高于其他组。强制氧化0～9 d，紫苏提取物添加组与TBHQ添加组的过氧化值无显著差异；强制氧化9 d后，TBHQ添加组的效果优于紫苏提取物添加组。60 ℃下强制氧化15 d后，茶多酚添加组的过氧化值为19.44 meq/kg，紫苏提取物添加组的裂壶藻油过氧化值相对茶多酚添加组的降低了21.35%；紫苏提取物中含有丰富的黄酮类、酚类等天然抗氧化剂，相比单一茶多酚添加组对裂壶藻油的氧化抑制效果更明显；TBHQ添加组的裂壶藻油过氧化值为13.52 meq/kg，相比紫苏提取物添加组的降低了11.58%，说明紫苏提取物的抗氧化效果略低于TBHQ。综上，3种抗氧化剂提高裂壶藻油氧化稳定性的效果为0.02% TBHQ>0.10%紫苏提取物>0.04%茶多酚。

2.2.2 丙二醛值 由图6可知，强制氧化第3天，空白组裂壶藻油的丙二醛值开始明显高于其他组。其中，茶多酚添加组丙二醛值于强制氧化第6天开始明显高于紫苏提取物添加组和TBHQ添加组。强制氧化第15天，与空白组相比，紫苏提取物添加组、茶多酚添加组和TBHQ添加组丙二醛值分别降低了47.79%，33.77%，51.82%，紫苏提取物和TBHQ抑制丙二醛升高的效果显著高于茶多酚(P<0.05)。

2.2.3 茴香胺值 由图7可知，强制氧化第6天，空白组的茴香胺值增加趋势显著高于抗氧化剂添加组(P<0.05)，强制氧化试验中，紫苏提取物和TBHQ降低茴香胺值的效果优于茶多酚；与空白组相比，紫苏提取物添加组、茶多酚添加组和TBHQ添加组的茴香胺值分别降低了33.02%，24.96%，41.23%。

图5 抗氧化剂对裂壶藻油过氧化值的影响Figure 5 The effect of different antioxidants on the peroxide value of Schizochytrium oil

图6 抗氧化剂对裂壶藻油丙二醛值的影响Figure 6 The effect of different antioxidants on the malondialdehyde value of Schizochytrium oil

图7 抗氧化剂对裂壶藻油茴香胺值的影响Figure 7 The effect of different antioxidants on the anisidine value of Schizochytrium oil

2.2.4 共轭二烯值 由图8可知，强制氧化期间，各组共轭二烯值均上升。其中，强制氧化0～9 d，0.10%紫苏提取物组与0.02% TBHQ组的共轭二烯值无显著性差异(P>0.05)。强制氧化第15天，紫苏提取物添加组相比茶多酚添加组共轭二烯值降低了12.45%，TBHQ添加组相比紫苏提取物添加组降低了14.47%，裂壶藻油中添加0.02% TBHQ对提高裂壶藻油氧化稳定性的效果最佳，紫苏提取物对延缓油脂氧化的效果略低于TBHQ。

图8 抗氧化剂对裂壶藻油共轭二烯值的影响Figure 8 The effect of different antioxidants on the conjugated diene value of Schizochytrium oil

2.3 抗氧化剂对裂壶藻油脂肪酸成分的影响

由图9、图10和表1可知，新鲜的裂壶藻油中不饱和脂肪酸相对含量为62.58%，其中以DHA为主，相对含量占47.66%。饱和脂肪酸以棕榈酸为主，相对含量占32.13%。经15 d的强制氧化试验，未添加抗氧化剂的空白组裂壶藻油的DHA、DPA等不饱和脂肪酸相对含量显著下降(P<0.05)，棕榈酸相对含量显著增加(P<0.05)。紫苏提取物添加组的DHA含量为41.50%，不饱和脂肪酸含量相比空白组提高了16.91%，说明紫苏提取物可以通过延缓不饱和脂肪酸的氧化分解起到抗氧化效果，这与紫苏提取物中酚类和黄酮类物质清除自由基的活性有关。与其他抗氧化剂组相比，0.02% TBHQ组的不饱和脂肪酸含量最高，达59.66%，与过氧化值、丙二醛值、茴香胺值以及共轭二烯值的检测结果一致。紫苏提取物对裂壶藻油的氧化抑制效果略低于TBHQ，不饱和脂肪酸含量仅减少了5.30%；紫苏提取物相比茶多酚不饱和脂肪酸含量显著增加了12.93%，抗氧化效果明显高于茶多酚。综上，各抗氧化剂对裂壶藻油氧化稳定性的作用效果为0.02% TBHQ>0.01%紫苏提取物>0.04%茶多酚。

图9 空白组裂壶藻油气相色谱图Figure 9 Gas chromatogram of Schizochytrium sp.oil in the blank group

图10 0.10%紫苏提取物添加组裂壶藻油气相色谱图Figure 10 Gas chromatogram of Schizochytrium sp.oil with 0.10% perilla extract

表1 抗氧化剂对裂壶藻油脂肪酸成分的影响Table 1 The effect of antioxidants on the fatty acid composition of Schizochytrium oil

3 结论

通过强制氧化法探究了不同剂量紫苏提取物、0.04%茶多酚、0.02% TBHQ对裂壶藻油氧化稳定性的影响。结果表明，紫苏提取物能有效延缓裂壶藻油的氧化，随着添加剂量的增加，裂壶藻油的氧化抑制效果也显著提高。与茶多酚和TBHQ的抗氧化能力相比，0.10%紫苏提取物对裂壶藻油的保护作用略低于0.02% TBHQ，但明显高于0.04%茶多酚。紫苏提取物作为一种天然产物，含有丰富的具有抗氧化活性的酚类、黄酮类化合物，这些物质的结构中带有能够有效清除自由基和活性氧的酚羟基，同时，紫苏提取物中各种抗氧化成分协同作用，有效阻隔油脂的链式氧化反应，比单一天然抗氧化剂能更有效地防止裂壶藻油的氧化，相比合成抗氧化剂TBHQ，紫苏提取物的使用也更加安全、可靠。后续可深入探究紫苏提取物对不同种类的油脂以及高油脂产品的氧化抑制作用，此外，探究紫苏提取物完整的抗氧化机制将是后续工作重点。