基于网络药理学的核桃防治老年痴呆功能成分及其作用靶点研究

许成梅，陈 丹，徐冬月，赵庆宇婧，林玉萍，赵声兰

（1.云南中医药大学中药学院，昆明 650500；2.云南省烟草质量监督检测站，昆明 650106；3.昆明海关技术中心，昆明 650200）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）俗称老年痴呆（dementia），是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变，是继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后，老年人致残、致死的第三大疾病。中国60岁以上的人口中，70%～80%伴有不同程度的健忘和痴呆，是世界上患者人数最多的国家［1］，严重危害和影响国人健康。AD的发病机制至今尚不明确，中医理论认为“以肾虚髓亏为本，痰瘀阻滞为标，五脏失调，脑髓失用”为老年痴呆之病机［2］。传统健脑药食同源核桃（Jug⁃lansregiaL.）仁营养丰富，古典记载“胡桃仁颇类其状”［3］，药典收载的功能为“补肾，温肺，润肠，用于肾阳不足、腰膝酸软、阳痿遗精、虚寒喘嗽、肠燥便秘”［4］，可用于防治老年痴呆［5-7］。核桃成分复杂多样，本研究通过网络药理学方法分析核桃防治AD的作用成分及其靶点和机制，为核桃仁用于老年病痴呆防治提供更多的科学依据。

1 材料与方法

1.1 核桃活性成分及潜在靶点的筛选

通过TCMSP（Traditional Chinese Medicine Sys⁃tems Pharmacology）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库［8］和相关文献获得核桃的化学成分及相应潜在靶点。口服生物利用度（OB）反映药物口服进入体循环的比例［9］，类药性（DL）是根据混合物的结构和性质表征成药特性，用于药物发现早期的初筛［10］。通常以OB≥15%和DL≥0.18作为筛选标准。此外，血脑屏障（BBB）是大脑与身体其他部位之间的高度选择性物理屏障，但它也阻止了许多治疗药物进入大脑参与反应，从而使疾病的治疗很困难。因此，它也是药物选择的重要参数。但随着年龄的增长以及神经血管和神经退行性疾病的发生，血脑屏障的通透性会有所增加［11］。

1.2 AD靶点搜集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（Therapeutic Target Database）（https：//db.idrblab.org/ttd/）和OMIM（https：//omim.org/）3个数据库［12］，以“Alzheimer′s Disease”和“dementia”为关键词搜索老年痴呆相关靶点，将3个数据库的靶点进行归并得到老年痴呆的靶点，以评分≥5为筛选条件，获得AD相关靶点。

1.3 潜在靶点分析

将核桃的潜在靶点与AD相关的靶点通过R3.6.2软件取交集，即为核桃作用于AD的潜在靶标。

1.4 网络构建

将交集靶点信息整理成Excel软件中的格式导入网络可视化软件Cytoscape3.7.2（http：//cytoscape.org/，v3.7.2）构建核桃“活性成分-药物-疾病-靶点”网络图，并运用Meta-analysis和Network Analyzer插件分析网络拓扑参数：选取节点度（Degree）前三位的活性成分为主要活性成分［13］，进一步了解核桃活性成分与AD相关靶点的相互作用关系。目前，STRING（Search Tool for Recurring Instances of Neigh⁃bouring Genes）是蛋白质相互作用覆盖种类最多的数据库［14］，将交集靶点导入STRING（https：//stringdb.org/）在线分析平台以获得蛋白质-蛋白质相互作用网络（Protein Protein Interaction Network，PPI）。蛋白质-蛋白质相互作用评分的置信度设置为0.900，并隐藏无相互作用的蛋白。将获得的PPI数据导出为TSV文件格式并导入到Cystoscape 3.7.2软件绘制网络图，利用Metascape和CytoNCA插件对其进行拓扑学分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表该点在网络图中越重要，取DC、EC、BC、CC值大于其2倍中位数进行关键靶点筛选［15］。

1.5 GO功能富集和KEGG信号通路分析

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库进行GO功能富集和KEGG信号通路分析。主要进行细胞、分子和生物三方面功能富集分析，以统计学超几何分布定量（P）评估相关性，设置P<0.01。

2 结果与分析

2.1 核桃活性成分筛选结果

以OB%≥15%，DL≥0.18为筛选标准，从TCMSP数据库获得核桃活性成分14种。相关文献报道核桃中许多其他成分可改善记忆衰退，预防AD，如芥子酸（Sinapic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、儿茶素（Catechin）、褪黑素（Melatonin）、丁香酸（Syringic acid）、槲皮素（Quercetin）、α-亚麻酸（alpha-Linolenic acid）、香豆酸（Coumaric acid）、亚油酸（Linoleic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、油酸（Oleic acid）、没食子酸（Gallic acid）、维生素E（Vitamin E）、绿原酸（Chlorogenic acid）和芦丁（Rutin）（OB：64.15%、54.97%、54.83%、52.96%、47.78%、46.43%、45.01%、43.29%、41.90%、39.56%、33.13%、31.69%、14.26%、13.61%、3.20%；DL：0.08、0.05、0.24、0.11、0.06、0.28、0.15、0.04、0.14、0.06、0.14、0.04、0.55、0.31、0.68）［16-26］。综合数据库搜索和文献报道，最终获得核桃活性成分29种（表1）。

表1 核桃潜在活性成分

2.2 核桃作用于AD的潜在靶点

基于所获得的29种化合物进行搜索，得到鞣花酸、2，2′，3，3′，4，4′-四甲氧基-6，6′-联苯二甲酸二甲酯、α-亚麻酸、咖啡酸、儿茶素、绿原酸、香豆酸、阿魏酸、没食子酸、亚油酸、褪黑素、油酸、槲皮素、芦丁、芥子酸、丁香酸和维生素E共17种化合物具有潜在靶点365个。从GeneCards和OMIM数据库获得2 645个与AD相关的靶点基因（评分≥5）。通过R3.6.2软件将AD相关靶点基因和核桃的成分潜在靶点相交，结果显示核桃成分的159个潜在靶标与AD相关（表2）。

表2 核桃成分中与AD相关的潜在靶点

2.3 网络构建

通过Cytoscape 3.7.2软件构建核桃“活性成分-药物-疾病-靶点”网络（图1）。该网络包含278个节点，核桃活性成分17个，作用靶点159个，423条相互作用的边。作用靶点最多的成分为槲皮素、油酸、鞣花酸、芦丁和阿魏酸；受最多化合物作用的靶点为前列腺素过氧化物合成酶（PTGS1/2）、视黄酸受体（RXRA）、转录因子p65（RELA）、单胺氧化酶（MAOB）和一氧化氮合酶（NOS3）等。表明核桃通过多成分、多靶点共同作用来防治AD。

图1 核桃活性成分-靶点网络

续表2

将159个靶基因输入STRING数据库进行分析，获得靶点蛋白相互作用关系网络（图2）。关键蛋白为RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、丝裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、转录因子AP-1（JUN）、转录因子p65（RELA）、白介素-6（IL6）等（图2）。这些蛋白可能在核桃防治AD中起关键作用。

图2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图（上）和关键蛋白排序（下）

2.4 GO功能富集分析

采用DAVID数据库，对核桃的159个AD相关靶点进行细胞、分子和生物3个方面功能进行富集分析（P<0.01）（图3）。其中，细胞成分主要涉及细胞外间隙（P=2.19E-24）、胞外区（P=3.01E-12）、细胞溶质（P=9.45E-09）、质膜（P=7.85E-07）和小窝（P=1.47E-06）等；分子功能主要涉及酶结合（P=5.03E-19）、相同的蛋白质结合（P=2.20E-16）、蛋白质同二聚化活性（P=3.22E-14）、蛋白质异二聚化活性（P=1.00E-11）和蛋白质结合（P=4.88E-11）等；生物过程主要包括对药物的反应（P=1.91E-23）、老化（P=4.10E-18）、对缺氧的反应（P=1.62E-16）、细胞增殖的正调控（P=4.15E-16）和凋亡过程的负调控（P=4.15E-16）等，表明相关靶点通过调控不同生物学功能作用于AD。

图3 GO功能富集结果

2.5 KEGG通路分析

对核桃的159个AD相关靶点进行KEGG通路富集分析（P<0.01），筛选得到160条相关通路，前30条重要通路见图4。其中，尿病并发症中的AGERAGE信号通路（P=7.88E-25）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（P=6.40E-22）、PI3K-Akt信号通路（P=5.93E-16）、白细胞介素-17信号通路（P=3.77E-15）、HIF-1信号通路（P=4.91E-15）、TNF信号通路（P=8.51E-15）可能为核桃不同成分作用于AD的关键通路。

图4 KEGG通路分析结果

3 讨论

网络药理学以系统生物学为基础，系统阐述药物成分与机体相互作用的原理与规律，可用来预测中药单体［27］或复方［28］的各有效成分及其作用靶点和参与的相关通路，探索药物与疾病间的关联性，解释中药治疗疾病的作用机制。本研究应用网络药理学方法筛选得到核桃17种活性成分具有AD相关的潜在靶点159个，主要为酚类、脂肪酸、黄酮类化合物。槲皮素、油酸、鞣花酸、芦丁和阿魏酸等显示出较强的靶向作用，均可改善认知，延缓记忆衰退。槲皮素可减轻大鼠记忆障碍，其机制可能与调节海马和前额叶皮质中Copine 6和TREM1/2的BDNF相关表达失衡有关［26］。鞣花酸具有神经保护作用，它可以改善AD相关的认知障碍，可能是由RAC-ine丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶/糖原合酶激酶3β（AKT1/GSK3β）信号介导的［22］。本研究获得的PTGS1/2、RXRA、RELA、MAOB和NOS3可能是AD的关键靶点。RXR是胆固醇合成和代谢的关键调节剂，RXRA是核配体激活的转录因子家族的成员，AD患者的胆固醇代谢会发生改变，RXRA基因变异可能通过影响脑胆固醇代谢而成为AD的危险因素［29］。在AD的淀粉样斑块周围可观察到反应性星形胶质细胞，反应性星形胶质细胞通过MAOB异常而产生抑制性胶质递质GABA，在AD模型小鼠的齿状回释放的GABA通过作用于突触前GABA受体而降低颗粒细胞的刺激率；在AD患者死后，脑中GABA和MAOB显著上调，选择性抑制GABA的合成或释放可能是治疗AD记忆障碍的有效策略［30］。认知障碍大鼠白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子ɑ（TNF-ɑ），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达显著增加，且炎症因子水平与Aβ42沉积呈正相关［31］，所涉及的靶点均为本研究中发现的AD相关重要靶点。

KEGG通路分析获得的一条重要通路为尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，AD与糖尿病关系密切，具有相似的病理改变，被称为“第3种糖尿病”［32］。研究表明，糖尿病脑病的特点是认知障碍、神经化学和结构异常，可通过下调BACE1、抑制AGE/RAGE轴和脑内炎症进行改善［33］。PI3K/Akt信号通路通过发挥抗氧化、抗炎和神经保护作用而在调节AD中起重要作用［34］。β淀粉样蛋白（Aβ）沉积是AD的发病机制之一，AD的发生与缺氧有一定关系。在分子水平上，缺氧应答主要靠HIF-1进行调节和介导，HIF-1的高表达可以通过与BACE1启动子结合，继而诱导BACE1的表达并导致Aβ水平升高［35］。

尽管目前AD的发病机制尚不明确，核桃的健脑功能也有待开发，但借助网络药理学研究显示核桃可从多成分、多靶点、多途径协同干预AD的发生和发展，其中作用靶点最多的成分为槲皮素、油酸、鞣花酸、芦丁和阿魏酸，受最多化合物作用的靶点为前列腺素过氧化物合成酶、视黄酸受体、转录因子p65、单胺氧化酶和一氧化氮合酶，为核桃防治AD的功能成分和靶点机制提供了数据和理论支持。