爆炸物原料过氧化氢的比色和荧光可视化检测方法探讨

曹洄鱼，李毓姝，王广发*，窦新存*

（1.爆炸物安全科学自治区重点实验室，中国科学院特殊环境功能材料与器件重点实验室，中国科学院新疆理化技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830011；2.中国科学院大学，材料与光电研究中心，北京 100049）

近年来，全球范围内恐怖活动蔓延，爆炸恐怖袭击案件频发，严重威胁了人民群众的生命和财产安全［1］。据全球恐怖袭击数据库（Global Terrorism Database）统计，全球仅在2019 年就发生了8 000 多起恐怖袭击事件，造成超过20 000 人死亡。基于打击恐怖主义、维护世界人民安全的迫切需要，爆炸物检测技术受到了世界公共安全领域的高度重视。针对典型制式爆炸物2，4，6-三硝基甲苯、2，4-二硝基甲苯和环三亚甲基三硝胺等的检测方法，科研人员开展了大量研究［2－3］。然而，随着各国对制式爆炸物的管控日益严格，非制式爆炸物由于其价格低廉、易于购买、制备工艺简单等特点而成为爆恐分子的首选。中国科学院新疆理化技术研究所爆炸物安全科学自治区重点实验室针对常见非制式爆炸物尿素、硫、亚硝酸盐、高氯酸盐等的检测开展了系统研究，包括基于异丙醇钾和二甲基亚砜体系的亲核加成反应和碱催化氧化诱导的电子转移原理，设计获得了可同时比色识别三硝基甲苯、二硝基甲苯、硫和高锰酸钾的多目标爆炸物比色检测试剂［4］；从影响比色检测灵敏度的载体入手，设计并制备具有斯坦纳网络结构的纤维膜和亲疏交替锁水网络结构的水凝胶基底，通过降维和限域策略极大地提高了检测灵敏度［5－6］；从构筑模式和判别方法入手，实现对多种非制式爆炸物原料和混合爆炸物的精准识别［7－8］；通过阳离子铂配合物的超分子自组装体系和精确调控荧光团结合位点的设计，分别实现对非制式爆炸物高氯酸盐和亚硝酸盐的高灵敏荧光检测［9－10］等。

近年，以三过氧化三丙酮（TATP）、六亚甲基三过氧化二胺（HMTD）等为代表的过氧化物类爆炸物由于具有原料易得、容易合成且爆炸威力巨大等特点，逐渐被恐怖分子广泛使用［11］。如2015年的法国巴黎袭击爆炸案、2016年比利时布鲁塞尔机场和地铁站爆炸案、2018年印度尼西亚泗水教堂爆炸案和2019年斯里兰卡连环爆炸案等典型恐怖袭击事件中均使用了TATP［12］。H2O2不仅是制备PBEs的前驱体，而且还是PBEs的分解产物［13］。目前，科研人员主要通过检测H2O2的方法实现间接检测PBEs的目标［11］。此外，H2O2和燃料混合（如酒精和丙酮）也是威力巨大的爆炸物［13］。因此，开展对爆炸物原料H2O2的检测对维护国家安全和社会稳定具有十分重要的意义。

科研人员开发出了大量基于H2O2检测的传感方法，包括质谱法［14］、色谱法［15］、电化学法［16］和化学发光法［17］等。比色和荧光检测方法因特异性好、灵敏度高、结果可视化、操作简单和便于现场检测等优点而受到科研人员的广泛关注［18］。本文基于H2O2的可视化检测方法，从提高检测灵敏度的角度出发，总结了其从比色法的褪色到荧光法的点亮的发展历程［19－32］（表1），并对其未来的发展趋势进行了展望。

表1 典型比色和荧光可视化探针的性能对比Table 1 Comparison of performance of typical colorimetric and fluorescent probes

1 比色法可视化检测H2O2

化学比色法作为一种操作简单、结果直观的经典检测方法，早在公元初年，古希腊人就已经利用此方法通过五倍子溶液来测定醋中的铁。目前，化学比色法已被广泛应用于生物、环境等诸多领域，其在爆炸物检测领域中的应用也得到了进一步发展［18］，从可视化的角度可以将其分为褪色和显色的化学比色反应。

由于H2O2也是生命体和活性氧的重要组成成分之一，许多科研人员对H2O2在生物检测中的比色和荧光检测方法进行了探索。其中，基于过氧化物酶（最常用的为辣根过氧化物酶）的比色和荧光可视化检测方法主要是利用专一性的催化反应，通过产生的羟基自由基进行检测。传统基于过氧化物酶的检测方法因生物相容性优异、灵敏度高、线性范围宽等优点而在检测生命活动中H2O2领域具有明显优势。针对爆炸物中H2O2的可视化检测方法则需要优异的环境适应性，科研人员设计合成了大量具有特异性比色和荧光检测H2O2的试剂或探针。目前，已有大量文献对基于过氧化物酶的检测方法进行系统总结［33－35］，因此，本文聚焦于现场可视化检测非制式爆炸物原料H2O2。

1.1 基于褪色的比色可视化检测

目前，基于褪色的比色检测方法主要利用H2O2的氧化性和还原性，通过其与比色底物发生反应造成底物褪色而实现检测。利用H2O2的还原性进行检测的方法主要有高锰酸钾法和铈量法。在酸性条件下，紫红色的KMnO4被H2O2还原生成Mn2+，导致溶液褪色实现检测。当KMnO4过量时，呈现粉色，裸眼检测限和光谱检测限分别为3µmol/L 和0.3µmol/L［20］。类似地，橙黄色的Ce4+也可被H2O2还原成Ce3+而产生褪色，通过微量滴定平板吸光度法实现H2O2的连续、特异性测量［36］。

利用H2O2的氧化性还可以实现Mo2O5（OH）和亚甲基蓝的褪色。深蓝色的Mo2O5（OH）可被H2O2或PBEs氧化生成白色的MoO3固体，导致蓝色迅速消失实现检测。当过氧化物过量时，则生成黄色的钼过氧配合物固体［37］。此外，在碱性条件下，H2O2通过N-去甲基化作用导致亚甲基蓝分解，实现褪色检测［38］。2019年，韩国全南大学Kim课题组利用该原理，以新亚甲基蓝作为自由基引发剂和传感反应位点，通过一步法制备响应速度比游离的染料分子快（>1 100%）的水凝胶颗粒，实现了对H2O2的快速检测（图1A）［21］。

图1 利用新亚甲基蓝的双重作用制备水凝胶颗粒及其与H2O2反应的示意图（A）［21］，草酸氧钛铵与H2O2的反应机理图（B），基于纸巾的纸基传感器检测H2O2蒸气前后的照片以及光学显微镜照片（C）［24］Fig.1 Depiction of the dual role of new methylene blue（NMB）in the preparation of hydrogel particles and the reaction with hydrogen peroxide（A）［21］，the reaction mechanism of ammonium titanyl oxalate with hydrogen peroxide（B），photographs of a piece of paper towel based sensor before and after exposed to the vapor of H2O2 solution and an optical microscope photo（C）［24］

综上，通过H2O2的还原和氧化性质进行褪色检测时，主要是利用离子价态变化和分解生色团两种方式。这两种探针设计方法有效地实现了H2O2的可视化检测，然而依旧面临如何进一步提高检测的灵敏度这一难题。

1.2 基于显色的比色可视化检测

与基于褪色的可视化检测方法相比，基于显色的可视化检测方法由于无背景颜色干扰，可实现较高灵敏的可视化检测。目前，基于显色的可视化检测方法包含间接和直接检测策略。间接检测策略主要基于淀粉碘化钾反应和芬顿反应。南非国家物理实验室Savage课题组［39］在1951年首次报道了使用KI和淀粉间接比色检测H2O2，其原理为H2O2首先氧化KI为单质碘，碘单质进而遇淀粉变蓝。美国梅奥医学中心和基金会的Penniston 课题组［22］在上述KI 和淀粉方法的基础上加入钼酸铵，实现了微摩尔级别H2O2的检测。基于芬顿反应的比色法间接检测H2O2是基于H2O2将Fe2+氧化为Fe3+，而Fe3+进一步与二甲酚橙反应生成蓝紫色络合物（邻甲酚砜－邻苯二甲酸3′，3′′-二（甲基亚胺）二乙酸酯）［23］。澳大利亚麦考瑞大学Gebicki 课题组［40］在上述Fe2+和二甲酚橙的基础上加入山梨醇以提高消光系数，实现了可视化检测信号辨别度的提升。另一种芬顿反应同样是基于H2O2的氧化性将Fe2+氧化为Fe3+，进而与SCN－反应生成红色的三价硫氰酸铁络合物，从而实现对H2O2可视化检测信号的显著提升［33，41］。

不同于上述基于间接比色实现可视化检测H2O2的方法，基于正钛酸钛对H2O2的检测是基于二者的络合反应实现的一种直接显色检测方法［42］。在不同pH值条件下，反应产物在溶液中的离子形式和显现出的颜色复杂。目前，普遍接受的机理是在pH<1的酸性条件下，得到最大吸收波长约为400 nm 的钛氧三元环Ti（O2）2+，使得颜色由无色变为黄色［24，43－45］。据此，美国犹他大学臧泠课题组制备了草酸氧钛铵包覆的基于纤维素微纤维网络结构的纸基传感器。该传感器提供了一种可调谐的界面，用于H2O2结合和反应生成钛过氧配合物，可检出十亿分之一（ppb）级别以下的H2O2蒸气（图1B、C）［24］。通过改变钛的配位环境，形成不同结构、不同颜色的配合物，从而实现对H2O2的比色检测。日本东京药科大学Takamura 课题组选用钛和4-（2'-吡啶偶氮）间苯二酚（4-（2'-Pyridy1azo）resorcinol，PAR）的混合溶液Ti－PAR 作为比色试剂，由于H2O2与Ti－PAR 形成三元钛配合物，PAR 中醌结构的共轭双键体系导致溶液相比于Ti（O2）2+的摩尔吸光系数更大，从而产生无色到红色的显色现象［46－47］。之后，该课题组利用2-（（5-溴吡啶）偶氮）-5-（N-丙基-磺酰氨基）苯酚二钠（2-（（5-Bromopyridyl）azo）5-（N-propyl-Nsulfopropylamino）phenol，PAPS）代替PAR，得到Ti－PAPS 试剂，通过与H2O2形成摩尔吸光系数和波长变化更大的紫红色钛络合物，实现对H2O2更加灵敏和特异的可视化检测［48］。

目前，基于显色的可视化检测方法主要是利用H2O2的氧化性和过氧键形成络合物实现。这种方法具有较高的灵敏度，然而依然无法满足在爆炸物检测领域中超痕量可视化现场检测的要求。

2 荧光法可视化检测H2O2

荧光检测法除了同样具有响应速度快、操作简单、结果可视化、便于现场应用等优点，灵敏度通常较比色检测法高1～3 个数量级且线性范围更宽［1，49］。因此，研究人员基于荧光检测法在爆炸物检测领域中进行大量研究。基于H2O2的两亲性质（亲电和亲核）和氧化性质，开发了多种可实现选择性检测H2O2的化学反应，如硼酸酯氧化反应、Baeyer－Villiger 氧化重排反应等。从可视化角度出发，荧光检测方法可分为猝灭型、比率型和点亮型。

2.1 基于荧光猝灭的可视化检测

基于荧光猝灭的可视化检测方法，主要通过苯酚氧化、醛基氧化和硼酸酯氧化三种反应机理实现。中国科学院大连化学物理研究所韩克利课题组［50］在2012 年首次报道了基于苯酚氧化为醌的检测机理，设计合成了多巴胺－花菁素荧光探针，利用H2O2将多巴胺传感基团的苯酚氧化为醌，进而与荧光团七甲花菁发生供电子体光诱导电子转移（PET），实现了对H2O2的荧光猝灭检测（图2A）。中国科学院上海微系统与信息技术研究所程建功课题组［25］基于醛基氧化为羧基的反应，设计合成了用于荧光猝灭检测H2O2和三过氧化三丙酮（TATP）蒸气的多甲酰苯酚/胺体系，检测限分别为1×10－4和0.2 nL/L。该反应具有高灵敏和快响应的优点，提供了一种新的检测PBEs 蒸气的传感构建思路（图2B）。英国巴斯大学Sedgwick 课题组［51］基于硼酸酯氧化为酚的反应，在2018 年合成了二苯乙烯硼酸酯荧光探针CTSBA，H2O2氧化水解硼酸酯基团为供电子苯酚基团，使得拉－拉体系变成推－拉的分子内电荷转移（Intramolecular charge transfer，ICT）体系，实现了H2O2的荧光猝灭检测。

图2 荧光探针多巴胺－花菁素检测H2O2的机理图（A）［50］，探针TFP－Ⅰ与H2O2的反应机理及检测H2O2蒸气前后的薄膜荧光照片（B）［25］Fig.2 Mechanism of detecting hydrogen peroxide with fluorescent probe dopamine－cyanine（A）［50］，the reaction mechanism of probe 2，4，6-triformyl phenol（TFP－Ⅰ）with hydrogen peroxide and the fluorescence photographs of the film before and after detection of hydrogen peroxide vapour（B）［25］

综上，采用苯酚氧化为醌，醛基氧化为羧基和硼酸酯氧化为苯酚的反应机理进行荧光猝灭检测H2O2时，主要利用其氧化性质，通过PET、ICT等机理实现可视化检测。然而，如何排除背景荧光信号干扰从而提升荧光可视化检测的灵敏度仍有待进一步探索。

2.2 基于比率荧光的可视化检测

基于猝灭的可视化检测方法是通过测量单一荧光强度信号从强变弱而实现，而比率荧光是通过测量两个或多个荧光信号的强度比实现，提供了内置的自校准功能。因此，可以排除探针浓度、探针所处环境及激发光强度等因素的影响［52］。ICT 和荧光共振能量转移（FRET）两种机理常用于设计比率荧光探针分子［53］。美国加利福尼亚大学伯克利分校Chang 课题组［54］基于ICT 机理设计了荧光探针分子PL1，利用H2O2裂解硼酸酯基修饰的氨基甲酸酯基团导致ICT消失，实现蓝色到绿色的比率检测H2O2。该课题组还设计了基于两个荧光团（香豆素供体和硼酸酯保护的荧光素受体）的探针RPF1，利用硼酸酯氧化反应调节FRET供体和受体之间的光谱重叠程度，从而实现对H2O2从蓝色到绿色的比率荧光检测（图3A）［55］。构建FRET的前提是供－受体间的发射－吸收光谱高度重叠，而利用ICT电荷转移过程调控供－受体光谱重叠程度能控制FRET 开启/关闭。基于此，南开大学尚鲁庆课题组［27］设计合成了双机制（ICTFRET）荧光探针CNP，利用H2O2水解硼酸酯基团为苯酚基团，导致荧光团萘二甲酰亚胺产生ICT 过程使得吸收光谱红移，进而与香豆素荧光团发生FRET，实现了对H2O2检测限低至0.28µmol/L 的比率荧光检测（图3B）。

此外，通过构建荧光探针功能化量子点体系同样能实现H2O2的比率荧光检测。葡萄牙波尔图大学Ribeiro课题组［56］设计了3-巯基丙酸修饰的橙色CdTe量子点与碳量子点的双发射量子点检测体系。以蓝色碳量子点作为内标，H2O2氧化巯基基团，引起量子点表面缺陷增加荧光猝灭，实现了比率检测。科研人员还通过化学反应将特异性检测待测物的配体连接在量子点上构成纳米探针，实现对H2O2的比率荧光检测［28－29，57］。长沙理工大学杨盛课题组［29］设计了硼酸酯功能化的部花菁探针分子修饰的双光子石墨烯量子点检测体系，能够实现对H2O2从绿色到蓝色的比率荧光检测，检测限为0.05µmol/L（图3C、D）。

图3 荧光探针RPF1与H2O2的反应机理图（A）［55］，荧光探针CNP检测不同浓度H2O2的荧光光谱图（B）［27］，部花菁修饰双光子石墨烯量子点体系检测H2O2的示意图（C）及在不同浓度下的荧光光谱图（D）［29］Fig.3 Mechanism of detecting hydrogen peroxide with fluorescent probe RPF1（A）［55］，the fluorescence spectra during the incubation of CNP with different concentrations of hydrogen peroxide（B）［27］，schematic illustration of the detection of hydrogen peroxide by two-photon graphene quantum dots masked with merocyanine probe（C）and fluorescence spectra at different concentrations（D）［29］

综上，从机理设计和体系构建两个角度出发，通过比率荧光探针和功能化量子点体系设计，利用ICT/FRET 传感机制和量子点的优异光学性质，建立了比率荧光高效检测H2O2的方法，能够实现高灵敏、高选择性的可视化检测。

2.3 基于荧光点亮的可视化检测

与猝灭型和比率型的荧光检测方法相比，基于点亮型的荧光检测方法因无背景信号干扰，能够实现更高灵敏度的可视化检测，而受到了广泛关注。

目前，荧光点亮检测H2O2主要基于硼酸酯氧化反应、Baeyer－Villiger 氧化重排反应和其它类型反应。特异性高的硼酸酯氧化反应机理可视化检测方法是近年最常用的荧光检测H2O2的反应［58］。这类荧光探针的设计策略是将识别基团硼酸酯/硼酸通过连接体与荧光团相连，利用硼酸酯或硼酸基团猝灭荧光团，H2O2能够水解识别基团为羟基，从而实现荧光点亮检测［31，59－61］。中南大学宋相志课题组［31］利用硼酸酯作为识别基团，1，3-双（双吡啶-2-亚胺基）异吲哚啉-4-醇为荧光团，通过醚键连接设计合成荧光探针，H2O2能够断裂识别基团，使得激发态分子内质子转移过程恢复，达到了荧光点亮检测限低至9.1 nmol/L（图4A）。

与硼酸酯氧化反应相比，基于Baeyer－Villiger 氧化重排反应机理的可视化检测方法具有反应速度快、灵敏度高、无荧光背景干扰和特异性强的优点［58，62－63］。这类荧光探针的设计策略基于识别基团对硝基苯二羰基通过不同键与荧光团相连，而H2O2的存在使得苯偶酰重排释放荧光团，从而实现点亮检测。云南大学的周莹课题组［64］利用α-酮酰胺作为识别基团，吡喃腈荧光单元的衍生物作为荧光团，设计合成了荧光探针DCHP，达到了5.3µmol/L的荧光点亮检测限（图4B）。

图4 硼酸酯荧光探针分子检测H2O2的机理图（A）［31］，基于Baeyer－Villiger氧化重排反应的探针分子DCHP检测不同浓度H2O2的荧光光谱图（B）［64］，荧光探针NFDS与H2O2的反应机理及对应荧光照片（C）［32］，荧光探针GC－2检测H2O2的机理图（D）［30］Fig.4 Sensing mechanism of hydrogen peroxide detection by borate ester fluorescent probe（A）［31］，the fluorescence spectra of probe DCHP in the presence of different concentrations of hydrogen peroxide based on the Baeyer－Villiger oxidative rearrangement reaction（B）［64］，the reaction mechanism of probe NFDS with hydrogen peroxide and the corresponding fluorescent photograph（C）［32］，the reaction mechanism of fluorescent probe GC－2 with hydrogen peroxide（D）［30］

此外，还有一些基于其它反应机理的可视化检测方法，如芳基磺酰酯裂解机理和碳碳双键断裂机理。芳基磺酰酯裂解机理检测H2O2的荧光探针在水解条件下稳定且灵敏度高［32，65］，基于此，山东师范大学唐波课题组［32］设计了封闭的无荧光内酯状态的荧光素二磺酸盐探针NFDS－1，H2O2能使其水解脱保护，形成开环的荧光产物，实现荧光点亮检测限低至81.5 pmol/L（图4C）。此外，科研人员还尝试利用碳碳双键断裂机理实现荧光点亮可视化检测H2O2。该机理由中国药科大学王鹏课题组［30］于2018年首次报道，利用1，8-萘二甲酰亚胺作为荧光团，烯胺作为反应基团设计了荧光探针GC－2，H2O2能够使烯胺转化为酰胺，从而使得ICT恢复，进而实现荧光点亮的可视化检测（图4D）。

综上，荧光点亮的可视化检测方法是依据硼酸酯氧化反应、Baeyer－Villiger 氧化重排反应、芳基磺酰酯裂解反应等机理，设计具有特异性识别基团的探针分子，具有灵敏度高、选择性强的优点，是荧光检测领域的重点发展方向。

3 结论与展望

针对爆炸物原料H2O2，科研人员在开发比色和荧光的可视化检测方法方面做出了大量突出成果，这些方法的优势及未来的发展方向可概括为：①相比于褪色的比色检测方法，无背景颜色干扰的显色可视化检测方法能够实现更高灵敏的检测，而特异性探针分子设计是实现可视化检测方法的关键。因此，开发基于化学显色的探针分子是比色可视化检测的发展趋势；②荧光检测方法可实现高灵敏可视化检测，尤其是荧光点亮检测方法检测性能更为突出，是未来荧光可视化检测方法的重要发展方向；③化学显色和荧光点亮检测能够实现高灵敏度的检测，然而，如何进一步提升其抗干扰性能是急迫解决的难点问题。未来可采用双模检测方法，利用荧光法排除环境中有色物质的干扰，利用比色法排除环境中荧光物质的干扰，有望提升检测体系的抗干扰性能。因此，结合比色检测和荧光检测在特异性和灵敏度方面的优势，开发基于化学显色和荧光点亮的双模探针分子体系，对可视化检测的发展具有重要意义。