排石颗粒高效液相色谱法指纹图谱研究及薄层色谱鉴别

李柯城，袁铭铭，熊晓丽，周国平

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

排石颗粒由连钱草、石韦、木通、盐车前子、徐长卿、忍冬藤等十味药组成。具有排石通淋、清热的作用，临床主要作用于肾结石和尿路结石，疗效良好［1-3］。排石颗粒收载于《中国药典》（2020年版一部），但质量标准相对较低，不能全面控制排石颗粒的质量。且排石颗粒指纹图谱相关的报道较少，色谱峰指认及归属不全，鉴别方法单一［4-8］。因此本研究收集了15 个不同批次的排石颗粒，建立了高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱，确立了25 个共有峰，指认了咖啡酸、绿原酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸酯、1,2-二咖啡酸-环戊基-3-醇、迷迭香酸5 个化学成分，归属了12 个未知峰。同时建立了排石颗粒中木通成分akemisaponin E、皂苷 PJ1 的薄层色谱（TLC）鉴别［9-10］。为排石颗粒质量评价方面提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Scientific Ultimate3000 系列高效液相色谱仪，Chromeleon 7 工作站，DAD 检测器；Milli-Q Advantage A10 纯水仪；KQ-500DE 超声仪；MS205DU电子天平（十万分之一）；ME204TE 电子天平（万分之一）；DHG-P076A 干燥箱；HPTLC Silica gel 60 薄层板。

1.2 试药

对照品绿原酸（批号110753-202018），对照品咖啡酸（批号110885-201703），对照品迷迭香酸（批号111871-201404），购于中国食品药品检定研究院。对照品1,2-二咖啡酸-环戊基-3-醇、4,5-二咖啡酰基奎宁酸酯、Akemisaponin E、皂苷PJ1 均由本课题组自制，经MS、1H-NMR 和13C-NMR 鉴定，HPLC 法检测面积归一化法计算纯度均在98.0%以上。乙腈、甲醇为色谱纯（美国Sigma 公司），水为Milli-Q 超纯水，其余试剂为分析纯。

15 批排石颗粒均来自江西南昌济生制药有限责任公司［S1～S15，批号200501（无糖型）、200114-2、191209-3、190705-2、190708-2、190706-2、190706-1、200114-2、191121-2、191111（无糖型）、210217-1、210202-1、210202-2、200715-2、200604-2］。10 味药材样品连钱草、木通、石韦、滑石、苘麻子、盐车钱子、徐长卿、忍冬藤、瞿麦、甘草，经江西省药品检验检测研究院周国平主任中药师鉴定。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液

取排石颗粒样品5 g（无糖型1 g）精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL。称定重量，超声（频率60 kHz，温度25 ℃）30 min，取出放冷，50%甲醇补重，摇匀，过滤，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 混合对照品溶液

称取咖啡酸对照品，绿原酸对照品，迷迭香酸对照品，4,5-二咖啡酰基奎宁酸酯，1,2-二咖啡酸-环戊基-3-醇对照品适量，精密称定，加适量50%甲醇稀释成浓度分别为0.118、0.131、0.117、0.220、0.124 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 阴性样品溶液

按《中国药典》（2020年版一部）排石颗粒处方称取药材，按制法制备10 份空白溶液（分别缺连钱草、缺木通、缺石韦、缺滑石、缺苘麻子、缺盐车钱子、缺徐长卿、缺忍冬藤、缺瞿麦、缺甘草），再按“2.1”项下制备阴性样品溶液。

2.4 色谱条件

Thermo Scientific C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇∶乙腈（1∶1，v/v）（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，见表1。体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 µL；检测波长284 nm。

表1 流动相梯度洗脱表

2.5 排石颗粒指纹图谱方法学

2.5.1 精密度试验 取排石颗粒样品（S1）约1 g，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.4”项下记录HPLC 图谱，连续6 次测得各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD 均小于2%。表明仪器的精密度良好。

2.5.2 重复性试验 精密称定排石颗粒样品（S1）6 份，每份约1 g，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.4”项下记录HPLC 图谱，测得各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD 均小于2%。表明仪器的重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取排石颗粒样品（S1）约1 g，按“2.1”项下方法制备供试品，置室温下放置0、2、4、8、12、24 h 后按“2.4”项下记录HPLC 图谱，测得各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD 均小于2%，表明排石颗粒供试品在室温下24 h 内稳定。

2.6 排石颗粒指纹图谱的建立

2.6.1 参照峰的选择 观察HPLC 图谱，发现相对于其他色谱法而言，25 号色谱峰（迷迭香酸）的峰形较好、峰面积较大，且出峰时间较稳定稳定，故作为参照峰。2.6.2 对照指纹图谱和共有指纹峰的标定 取各批次排石颗粒样品，按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件记录图谱，将HPLC 图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）进行峰匹配，采用多点校正法并生成对照图谱，共标示出25 个共有峰，建立了15 批排石颗粒的叠加指纹图谱，见图1。生成排石颗粒的共有指纹图谱，见图2。

图1 15 批排石颗粒的HPLC指纹图谱

图2 排石颗粒HPLC指纹图谱共有指纹图谱

2.7 相似度计算

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版）软件计算指纹图谱相似度，结果显示15 批排石颗粒相似度均大于0.952，见表2。说明不同批次间排石颗粒整体类似，产品质量稳定。

表2 15 批排石颗粒相似度结果

2.8 主要色谱峰的指认及归属

取阴性样品溶液，按“2.4”色谱条件记录图谱，根据对照品的保留时间、DAD 光谱图，以及混合对照品溶液、对照品溶液、供试品溶液、各阴性样品溶液的HPLC 图谱进行分析比较，指认出5 个主要色谱峰，如图3所示。对部分色谱峰进行指认及归属，见表3 所示。

图3 混合对照品HPLC色谱图

表3 色谱峰归属结果

2.9 排石颗粒的TLC 鉴别

2.9.1 供试品的制备 称取排石颗粒样品20 g（无糖型5 g）置圆底烧瓶内，加水饱和正丁醇200 mL，加热回流1 h，室温下放冷，滤过，滤液加氨试液洗涤3 次（每次100 mL），弃去氨试液层，加正丁醇饱和的水液洗涤2 次（每次20 mL），弃去水层，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇1 mL 溶解，得供试品溶液。

2.9.2 对照品的制备 称取对照品Akemisaponin E、皂苷PJ1 适量，加甲醇制成浓度分别为2 mg/mL，1 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.9.3 阴性对照的制备 照《中国药典》（2020年版一部）排石颗粒制法制备阴性对照（缺木通），称取5 g 阴性对照干品置圆底烧瓶内，与供试品溶液同法操作，得阴性对照溶液。

2.9.4 TLC 测定方法 照《中国药典》（2020年版四部附录）薄层色谱法［11］试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液以及混合对照品溶液各10 μL，点于同一块HPTLC Silica gel 60薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶9∶1）为展开系统，展开，取出，晾干，立即喷以10%硫酸乙醇显色剂，置105 ℃加热至斑点清晰，日光检视。结果显示供试品与混合对照品在相应位置上显相同颜色的斑点，而阴性样品无干扰，结果如图4 所示。

图4 排石颗粒木通阴性薄层色谱图

2.10 TLC 耐用性考察

薄层板的比较：考察了德国制HPTLC Silica gel 60硅胶G 板与青岛海洋化工制硅胶G 板的分离效果，结果表明两种不同品牌的薄层板对斑点的分离效果无明显差异。湿度的比较：控制温度为26 ℃，考察低湿（RH=20%）、常湿（RH=55%）、高湿（RH=75%）下的分离情况。结果表明，三种湿度条件下斑点的分离效果无明显差异。温度的比较：控制湿度为RH=55%，考察常温（T=26 ℃）和低温（T=8 ℃）下的分离情况。结果表明，常温和低温条件下分离效果无明显差异。

3 讨论

3.1 指纹图谱提取方式的考察

本实验考察了超声提取（频率60 kHz，温度25 ℃）和回流提取两种方式，结果显示超声提取更完全；同时考察了无水乙醇、30%乙醇、50%乙醇，70%乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇提取溶剂，结果发现用50%甲醇提取时，色谱峰较高，峰数量较多；提取时间考察了15 min，30 min和45 min，结果表明30 min 和45 min 提取效果接近，所以最终选择超声提取30 min。

3.2 HPLC 色谱条件的考察

本实验流动相组成考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水，结果显示以甲醇∶乙腈（1∶1）-0.1%磷酸水为流动相时基线平稳，峰型较好；柱温考察了20 ℃、30 ℃和40 ℃，结果表明在30 ℃时，排石颗粒供试品色谱图各峰分离效果最佳；色谱柱考察 了SHIMADZU C18、OSAKA SODA C18 和Thermo Scientific C18 三个不同品牌的色谱柱进行分析。结果表明Thermo Scientific 色谱柱的分离效果较好。

3.3 TLC 条件考察

展开剂考察了三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶10∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（12∶9∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲 酸（15∶9∶1）、正 丁 醇-甲 醇-甲 酸（20∶10∶1）、正丁醇-甲醇-水（15∶9∶1）系统，结果显示以三氯甲烷-甲醇-甲酸（15∶9∶1）为展开剂效果最佳，展开时间短，分离效果好；显色剂考察了10%硫酸乙醇试液、5%硫酸香草醛试液，结果显示10%硫酸乙醇试液显色效果较好。

4 小结

本实验建立了排石颗粒HPLC 指纹图谱，并对江西南昌济生制药有限公司的15 批排石颗粒进行定性分析，结果表明15 批排石颗粒未见明显差异。建立了排石颗粒中akemisaponin E、皂苷PJ1的TLC 鉴别，结果表明斑点清晰。本方法可用于定性评价排石颗粒的质量，对进一步完善排石颗粒质量评价方法提供参考依据。