贯叶连翘不定根粗提物对金黄色葡萄球菌的抑制影响

徐亚男， 刘懿萱， 廉美兰， 金美玉， 朴炫春

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种十分常见的革兰氏阳性致病菌，广泛存在于自然界中，传播途径较多，常在食品加工或医疗过程中被检测到，危害性较强[1]。金黄色葡萄球菌感染后极易引发皮肤伤口感染及脓肿，如肺炎，脑膜炎，心内膜炎，败血症[2]，严重时可危及生命。因此，为了减少由细菌感染引起的死亡，人们发现并开始使用抗生素，但随着细菌耐药性的产生令抗生素作用渐渐降低。而利用植物做成的天然制剂毒副作用小，有效成分多，可以代替抗生素的使用。许多研究表明，天然植物制剂可以通过改变菌细胞的通透性，使膜内物质溢出，核酸泄露，细菌繁殖受到抑制，无法完成正常代谢，具有很好的抑菌作用。如：秦皮素可明显抑制金黄色葡萄球菌的生长[3]；蒲公英植酸对沙门氏菌具有较强的抑制作用，通过增加细胞膜的通透性，干扰蛋白质代谢进而抑制细菌的生长繁殖[4]；芳樟醇可以影响细胞膜的结构和功能，使细胞膜通透性增大，细胞内物质丢失，ATP含量下降，细胞功能异常，导致细胞死亡[5]。

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)是藤黄科金丝桃属的多年生草本植物，被称为“植物药之星”[6]，主要产于新疆、山东等地区，国外南欧、非洲也有所分布，是我国传统的药用植物，具有极高的药用价值[7-12]，含有金丝桃素、金丝桃苷等。研究表明，贯叶连翘粗提物对许多细菌都有抑制作用，如蜡样芽孢杆菌[13]、黄色短杆菌[14]、枯草杆菌[15]、金黄色葡萄球菌[16]等。然而，具体抑菌机制未见相关报道。因此，该试验研究了贯叶连翘不定根粗提物对金黄色葡萄球菌的抑制机制，旨在为贯叶连翘不定根作为天然植物制剂应用于相关抑菌产品开发与生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验使用于晓坤[17]方法获得贯叶连翘不定根。将贯叶连翘不定根切成1 cm大小，接种于含有4 L培养基的气升式球形反应器中，培养基配方为MS+ IBA 1.25 mg/L+蔗糖40 g/L，pH值5.8 ，通气量为0.1 vvm，培养30 d后，获得材料，材料流水冲洗1 min并于烘干箱中烘干，即得贯叶连翘不定根干品，用于下述试验。

1.2 方法

1.2.1 供试菌种的培养

金黄色葡萄球菌购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。用接种环挑取菌种，培养于牛肉膏蛋白胨培养基(3 g/L牛肉膏+10 g/L蛋白胨+5 g/L氯化钠+15～20 g琼脂、pH值7.0～7.2)，37 ℃菌培养箱中培养，采用平板划线法培养24 h后计数，稀释至菌液浓度107～108CFU/mL，用于下述试验。

1.2.2 粗提物的制备

称取不定根干品2 g，利用闪式提取仪(JHBE-50T，上海钒帜精密设备有限公司)在提取时间65.44 s，甲醇浓度77.46%，料液比52.13 mL/g条件下进行提取，经减压浓缩后烘干至恒重，即得粗提物(HE)，提取率为30%。

1.2.3 抑菌活性测定

利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法[18](TTC)测定HE的最低抑菌浓度(MIC)。96孔板中每孔加入100 μL上述菌液和不同浓度的HE(64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/mL)后，以菌培养液作为对照，重复处理3次。在37 ℃恒温箱中培养24 h后，加入20 μL 0.2% TTC(北京索莱宝科技有限公司)溶液，再置于37 ℃下避光培养4 h，观察各处理组反应液的颜色，确定MIC。

1.2.4碱性磷酸酶(AKP)酶活性测定

菌液中AKP酶的活性用AKP酶试剂盒(南京建成科技有限公司)测定。150 mL锥形瓶中加入2 mL菌液和100 mL菌培养液，加入2 mg/mL(MIC)HE(5 mL)，对照加入菌培养液，于37 ℃下温育(130 r/min)4 h后，在5 000 r/min下离心8 min，取上清液作为待测样品。按照AKP酶试剂盒的说明书，空白组加入25 μL双蒸水，标准品组加入25 μL酚标准液(0.1 mg/mL)，样品组加入25 μL待测样品，最后分别加入1.5 mL显色剂、50 μL缓冲液和50 μL基质液。在分光光度计520 nm下测吸光度，计算AKP酶活性。

1.2.5 电导率(EC)测定

参照Yuan等[19]的方法测定菌液的电导率。在15 mL离心管中加入5 mL菌液，离心去上清，用PBS(10 mM，pH值7.4)洗涤3次后，加入5 mLPBS和HE后摇匀混合，使HE终浓度达到MIC(对照组加入等体积的菌培养液)。混合物于130 r/min下温育(37 ℃)，用电导率仪(DDSJ-308A，雷磁)测定不同时间的EC值。

1.2.6 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定胞外蛋白质浓度。将菌液离心去上清，菌细胞用PBS(10 mM，pH值7.4)洗涤3次，依次加入1 mL PBS、100 mL菌培养液和HE，使HE终浓度达到MIC(对照组加入等体积的菌培养液)。混合液离心4 min，取上清为待测样品。空白组加入25 μL双蒸水，标准品组加入25 μL蛋白标准品，样品组加入25 μL待测样品，最后加入1.5 mL显色剂。充分反应10 min后利用分光光度计于595 nm下测量吸光值。

1.2.7 核酸泄露测定

将菌液离心去上清，用PBS(10 mM，pH值7.4)洗涤3次后，加入1 mL PBS和100 mL菌培养液，加入HE，使HE终浓度达到MIC(对照组加入等体积的菌培养液)，离心4 min后，去上清，利用分光光度计在260 nm下测量吸光值。

1.3 数据分析

数据采用GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA)进行方差分析和t检验，显著性为P<0.05，所有试验均采用3次重复。

2 结果与分析

2.1 HE的抑菌活性

TTC作为一种氧化还原指示剂，可将活细胞被染成不同程度的红色。从图1可以看出，当HE浓度在2 mg/mL时，没有产生明显红色沉淀，2 mg/mL之前的样品均呈现出不同程度的红色，表明在HE浓度在2 mg/mL时，可以有效的抑制金黄色葡萄球菌的增殖，即HE的MIC为2 mg/mL。

加入HE后，细菌生长明显减缓，处理1.5 h时，对照组与HE处理组细菌生长出现明显不同，对照组细菌在2～3 h达到快速繁殖期，而HE处理组生长缓慢，说明HE能够有效抑制细菌的生长(图2)。

2.2 HE对AKP酶活性的影响

AKP酶仅存在于细菌的细胞膜和细胞壁之间，参与细胞膜上的能量代谢，而在细胞壁完整的状态下，在胞外无法检测到AKP酶，只有细胞壁损伤时才能泄漏到菌液中。从图3中可以看出，处理前在菌液中只能检测到微量的AKP酶活性，而处理4 h后，胞外AKP酶活性有极显著升高，说明HE对金黄色葡萄球菌的细胞壁有较好的破坏效果。

2.3 HE对电解质泄露的影响

从图4可以看出，加入HE后，电导率逐渐上升，在2 h后达到平稳状态。这表明在加入HE后，细胞膜通透性发生改变，会造成胞内K+、Ca2+、Na+等小分子物质的泄露渗出，导致电导率升高。

2.4 HE对蛋白质泄露的影响

蛋白质是构成细胞生命活动的主要承担者，作为细胞中的重要组成部分，许多代谢活动都与蛋白质有关。由图5可知，加入HE后，处理组与对照组相比，蛋白质浓度上升，可能是HE的加入，导致细胞膜破坏，从而向外渗透蛋白质。

2.5 HE对核酸泄露的影响

核酸是细菌的遗传物质，其吸光峰值一般在260 nm左右，故以OD260测定值代表核酸的含量。在加入HE处理4 h后，菌液中核酸含量明显上升，遗传物质泄露，细菌无法正常繁殖，从而有效抑制其正常生长(图6)。

3 讨论与结论

细菌作为所有生物数量最多的一类，广泛存在于大自然中的各个角落，或与其它生物共生。金黄色葡萄球菌作为世界10大致死菌之一，通过食物、空气、皮肤接触皆可传播，无时不刻不在危害人类的健康。1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第1种抗生素-青霉素，抗生素的出现极大减少由细菌感染造成的死亡[19]。随着抗生素广泛应用于临床，金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，并且呈现多重耐药性。在我国，每年有8万人因滥用抗菌药物死亡，全国医院抗菌药物年使用率高达74%[20]。寻找替代抗生素的药物成为急不可待的问题。通常，药用植物的天然产物是用于药用制剂重要来源。

现如今，许多植物都已被证实具有抑制金黄色葡萄球菌的作用。通常植物抑菌机制主要有3种：1) 破坏细胞壁或者细胞膜;2) 影响细菌呼吸;3) 影响细菌的遗传物质，抑制蛋白质合成，从而起到抑菌的效果[21]。如夹江石斛水提物通过改变细胞膜的通透性从而起到抑制金黄色葡萄球菌的作用[22]；蒋斌等[23]人证实连翘能抑制金黄色葡萄球菌的生长，作用机制可能与细胞膜通透性有关；蒋利荣等[24]人研究羊踟蹰其粗提物可通过破坏细菌细胞膜甚至细胞完整性，使得细胞内的导电离子及核酸物质外流，从而造成金黄色葡萄球菌的死亡。在该研究中，贯叶连翘不定根粗提物对金黄色葡萄球菌MIC是2 mg/mL，加入粗提物后，细菌生长变慢，AKP酶活性增强，同时菌液电导率上升，胞外蛋白质含量增多，核酸泄露增多，说明粗提物可使细胞膜的通透性发生改变，膜内物质渗出，抑制细菌生长。因此，为贯叶连翘不定根粗提物作为天然植物制剂代替抗生素的应用打下基础。