膜荚黄芪CBF基因的克隆及表达分析

李俊杰， 赵 洋， 哈 洋， 苏喆莹， 王景然， 全雪丽， 吴松权*

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133000；2.台头镇人民政府，山东 寿光 262735)

黄芪，又称黄耆、绵芪，是豆科黄芪属植物，主要分布在我国内蒙古、山西、甘肃、黑龙江、宁夏、吉林等北方地区[1]，作为临床常用中药，药用历史久远[2]。黄芪最早见于我国的《神农本草经》，李时珍在《本草纲目》中将其称之为黄芪，味甘，气微温，主入归肺、脾二经，具有补气健脾、升阳举陷、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌之功效[3-5]。《中华人民共和国药典》中规定正品黄芪为蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge. var.mongholicus(Bunge.) Hsiao)和膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge)的干燥根[6]。

CBF(C-repeatbindingfactor)是低温响应基因，在植物响应低温和调控途径中起着十分重要的作用,同时在不同植物物种对胁迫的响应中也发挥着不同的作用，有部分学者发现，CBF也能对其他非生物胁迫和激素作出反应，如高温、干旱、盐和脱落酸等[7-10]。已有研究发现，CBF基因在不同植物抗冻性调控中发挥关键作用[11]。当植物感受到低温信号时，CBF会快速进行响应，并结合到冷应答基因的启动子区域激活它们的转录表达[12-13]。该试验旨在了解膜荚黄芪中CBF基因的结构及其在低温与干旱胁迫条件下的表达量变化，为进一步研究CBF基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料

膜荚黄芪种植于延边大学农学院试验基地。不定根诱导采用李子羊等[14]的方法。待不定根长出后，利用B5+IBA(2 mg/L)培养基进行继代增殖培养，之后分别在4 ℃低温胁迫和15% PEG干旱胁迫条件下处理0、2、4 h并迅速置于液氮中冷冻，将处理后的样品保存于-80 ℃冰箱备用，重复3次。

1.1.2 试剂

SMARTerTMRACE cDNA5′-RACE和3′-RACE试剂盒，购自Clontech公司；Trizol试剂，购自Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒，购自 Toyobo公司；SYBRPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)荧光定量试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和PMD19-T载体，购自大连Takara公司。

1.1.3 主要仪器

DW-86L828超低温保存冰箱(Haier公司)、MJ-78A高压灭菌锅(上海施都凯公司)、T100TMThermal Cycler PCR仪(美国Bio-Rad公司)、干燥箱(上海施都凯公司)、高速冷冻离心机(Hitachi)、超微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000 C)、凝胶成像系统(美国UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成

采用Trizol一步法提取总 RNA，使用超微量分光光度计测定其浓度及吸光值；依据测定值计算并稀释RNA的浓度到500 ng/μL，并进行琼脂糖凝胶电泳检验。将所提取的RNA放置于-80 ℃超低温冰箱中保存。以提取的膜荚黄芪的RNA作为反转录的模板，参照反转录试剂盒的步骤合成cDNA的第1条链。

1.2.2 设计CBF基因的简并引物

用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的GeneBank数据库，搜索并下载已经收录在内的拟南芥、大豆等植物的膜荚黄芪CBF基因(AmCBF)的同源序列。利用多序列比对软件MEGA7进行比对，分析并确定CBF基因的保守区域。利用引物设计软件Primer Premier5.1设计CBF基因的简并引物，分别命名为AmCBF-ju1、AmCBF-jd1，引物的序列如表1所示。

1.2.3CBF基因保守区的克隆

以合成的cDNA第1条链为模板，进行PCR扩增，反应体系为20 μL：10×PCR Buffer2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，cDNA模板1 μmol/L，2.0 μL，上游引物AmCBF ju1 2.0 μL，下游引物AmCBF jd1 2.0 μL，5 U ExTaq酶0.2 μL，剩余用ddH2O补足。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，参照回收试剂盒说明书对DNA凝胶进行回收，参照T载体说明书连入 PMD-19T载体。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态JM109，通过对蓝色和白色的菌落进行筛选，白色菌落即是成功的转化子。将提取的重组质粒DNA 原液稀释50倍后，使用M13引物(表 1)进行PCR检测。对检测为阳性的克隆菌株进行测序，测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2.4 5′-RACE和3′-RACE扩增

参考SMARTerTMRACE cDNA 5′-RACE和3′-RACE试剂盒的说明书进行，根据目的基因保守序列的测序结果设计5′-RACE和3′-RACE特异引物，设计的引物序列如表1所示。PCR得到的产物按照步骤1.2.3进行回收、连接、转化并测序。

1.2.5CBF全长CDS的克隆

利用DNAstar软件对克隆所得到的基因保守序列以及5′-RACE和3′-RACE产物序列进行拼接分析，从而得到2个基因的全长序列。根据拼接的基因全长序列设计全长特异引物(表1)，验证基因的全长编码信息。

表1 引物序列

1.2.6 生物信息学分析

检索同源性氨基酸序列采用在线工具BLAST；分析基因的开放阅读框(ORF)采用Lasergene软件包中的EditSeq；预测编码蛋白的分子量和等电点等理化性质采用ExPASyProtParam服务器；利用ExPASyProtScale服务器分析蛋白疏水性；预测蛋白跨膜结构用在线工具TMHMM-2.0；预测蛋白质二级结构采用 SOPMA服务器，预测亚细胞定位情况采用在线工具TargetP1.1和WoLF PSORT；预测信号肽采用在线工具SignalP 5.0；利用MEGA7软件进行氨基酸序列比对分析以及构建CBF氨基酸序列系统发育进化树。

1.2.7 膜荚黄芪CBF荧光定量PCR分析

根据获得的AmCBF的特异序列设计1对荧光定量PCR引物(表 1)，所用内参基因为黄芪18S基因(Genbank登陆号为 AF359594，表 1)。以标准的AmCBF和18S基因拷贝数的对数值为横坐标，以测得的 CT 值为纵坐标，绘制各自的标准曲线。根据未知样品的 CT 值，即可在各自标准曲线中得到样品的拷贝数，再求出相对于内参基因18S的相对表达量。每组样品进行 3 次重复检测。

1.2.8 统计分析

AmCBF基因表达量数据的统计分析利用SPSS 19.0软件进行，个体差异利用Duncan多范围检验进行评估(P<0.05)，用标准差来代表误差。

2 结果与分析

2.1 AmCBF基因全长cDNA克隆与序列分析

使用表1中设计的简并引物AmCBF-ju1和AmCBF-jd1进行PCR扩增试验。得到的PCR产物经过回收、连接、转化和M13鉴定等操作，将最后得到的鉴定产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其过程中的相关图片如图1所示。PCR扩增后，膜荚黄芪基因CBF的片段长度约为240 bp。测序后，基因AmCBF的保守区域长度为230 bp，并将其命名为AmCBF-RT。

使用NCBI主页的BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.)对克隆得到的AmCBF-RT基因保守区进行同源性检测比较。其结果显示，膜荚黄芪CBF与豆科植物苜蓿(AC166046.15)、木豆(XM020350729.1)CBF基因的相似度分别为83%和86%。因此，初步认定克隆到的AmCBF是膜荚黄芪CBF基因的1个片段。

反转录试剂盒合成的第1条链，用表1中设计的特异性引物进行5′-RACE和3′-RACE的 PCR扩增实验。其过程中的PCR结果电泳图以及鉴定图如图2所示。

测序回来的结果显示，AmCBF基因5’序列的长度为572 bp，通过BLAST进行同源性检测分析，结果显示与豆科植物木豆(XM020350729.1)、赤豆(XM017585861.1)的序列相似性分别是87%和87%，因此，初步确定所得到的AmCBF基因5’是膜荚黄芪CBF基因的5’端；AmCBF基因3’序列的长度为425 p，通过BLAST进行同源性检测分析，结果显示与豆科植物苜蓿(XM003611110.2)、鹰嘴豆(XM004511547.2)的序列相似性分别是78%和78%，因此，初步确定所得到的AmCBF基因3’是膜荚黄芪CBF基因的3’端。

将5′-RACE和3′-RACE测序结果进行比对并拼接，从而得到理论上AmCBF基因的全长序列。分别设计基因的全长引物(表1)。以膜荚黄芪总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增试验。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 PCR鉴定结果显示与PCR扩增所得目的条带长度一致(图3)。故确定其为基因AmCBF的全长，并命名为AmCBF-cds。

2.2 AmCBF生物信息学分析

对AmCBF基因的全长序列进行分析(图4)。图中方框表示基因编码的起始密码子和终止密码子。AmCBF全长827 bp，其中，包括642 bp的开放阅读框(ORF)，54 bp的5’非翻译区(5′-UTR)，131 bp的3′非翻译区，其中包含25 bp的Poly尾；其A+T的含量为61.9%，G+C的含量为38.1%。

使用NCBI中的BLAST功能对AmCBF进行同源性检测，结果显示其与豆科植物狭叶羽扇豆(CP023126.1)的同源性为82%，并与其他豆科植物的CBF基因相似性也较高。初步证实该试验所克隆的CBF基因是膜荚黄芪CBF基因的序列。

对AmCBF所编码的蛋白质序列进行分析。结果显示AmCBF蛋白编码213个氨基酸，这与其它植物CBF蛋白编码氨基酸结果相似[15-16]。分子式为C1040H1632N308O331S10，分子量为24 066.86 Da，其理论等电点为5.84。该蛋白质中酸性氨基酸有31个，碱性氨基酸有27个，说明该蛋白质呈酸性，而且其不稳定系数为71.21，属于不稳定蛋白；亲水指数为-0.758，表明该蛋白为亲水性蛋白(图 5)，与山葡萄VaCBF3[17]生物信息学分析结果一致。亚细胞定位显示，位于细胞核和细胞质的可能性较大，预测概率分别为56.5%和21.7%，并且不存在信号肽。跨膜结构分析的预测结果显示，AmCBF没发现交汇区域，因此该基因所编码的蛋白都是非跨膜蛋白。与RcCBF[18]跨膜结构分析结果一致，RcCBF蛋白也没有跨膜结构，不属于跨膜蛋白。

通过使用PRABI在线分析软件对基因AmCBF预测编码的蛋白质二级结构预测结果如图6所示。AmCBF基因蛋白的二级结构包含29个α折叠，44个β折叠以及140个无规则延伸构成，分别占据13.62%、20.66%和65.73%。

为了深入研究AmCBF和其他物种CBF的进化关系，运用分析软件MEGA7构建CBF基因与其他不同物种CBF基因的进化树(图7)，AmCBF与豆科植物木豆(Cajanuscajan)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)的CBF归为Type Ⅱ，大豆(Glycinesoja)、毛豆(Glycinemax)、决明子(Sennatora)、黧豆(Mucunapruriens)的CBF归为Type Ⅰ，榴莲(Duriozibethinus)、蓖麻(Ricinuscommunis)、甜瓜(Cucumismelo)的CBF归为Type Ⅲ，白梨(Pyrusxbretschneideri)、海棠(Malussieversii)、梅花(Prunusmume)、杏(Prunusarmeniaca)的CBF归为Type Ⅳ。

进一步验证AmCBF在低温下的表达(图8)，在低温和干旱胁迫条件处理下，AmCBF表达量趋势相似，均为先上升后下降。且在胁迫处理2 h后，AmCBF表达量显著上升，在处理时间达到4 h后，基因表达水平均呈下降趋势，但其表达量仍与对照组有显著性的差异。综合分析表明，AmCBF在低温和干旱的胁迫处理条件下都能被诱导表达，且低温处理条件下表达量高于干旱处理，并且发现它们诱导表达的时间存在一定差异。

3 讨论与结论

CBF在调节植物生长发育和外界环境响应方面发挥着重要作用[19]，目前为止，学者们从拟南芥、番茄、大豆、葡萄等植物中克隆到了CBF基因并通过研究发现其有调节植物抗冷能力的作用[20-22]。在低温下植物细胞内的自由水减少，间接对植物造成干旱等逆境伤害。因此，抗冷和抵御干旱等逆境胁迫有密不可分的联系，CBF家族的部分成员对干旱逆境诱导也有响应[23]。该研究采用同源克隆法和RACE技术在膜荚黄芪中克隆得到了CBF基因，并分别在低温和干旱胁迫条件下处理0、2、4 h。荧光定量PCR分析结果表明，在2 h后表达量最高，4 h后表达量有所下降，且低温胁迫时表达量高于干旱胁迫。已有研究发现，低温胁迫下，CBF基因都具有瞬时表达特性。CBF基因在低温胁迫下短时间内即被强烈诱导并表达，但随着时间推移，诱导作用逐渐减弱[24]。如拟南芥CBF1、棉花GhDREB1基因的表达在2 h后达到表达高峰[25-26]；黑麦草CBF的表达高峰为2～4 h[27]。这与该试验结果一致，初步认定克隆得到的CBF基因是膜荚黄芪的基因序列。该研究中膜荚黄芪CBF基因的克隆和表达分析为CBF基因低温调控途径研究和抗寒分子机制研究奠定了基础。