复合酶法提取灵芝多糖工艺优化及果冻饮料开发

孙德鹏， 徐瀚然， 韩春姬， 汪庭瑞， 李官浩， 牟柏德*

(1.延边大学 农学院；2.延边大学 食品研究中心；3.延边大阳参业有限公司：吉林 延吉 133000)

灵芝属多孔菌科真菌赤芝，是一种珍贵的药材。灵芝中含有许多对人体有益的功能性营养成分[1]，如多糖类、三萜类化合物、矿物质等，具有促进血液循环、提高免疫力、改善肝功能等作用[2-4]。已报道的200多种灵芝多糖分为α型和β型[5]，单糖间通过苷键结合的形式决定了灵芝多糖的药理活性。许多研究表明，灵芝多糖还具有抑制肿瘤细胞增殖的作用[6]，能够抑制核酸的合成，诱导其调亡，并能调节机体免疫力来发挥作用[7-8]。酶法提取能使灵芝中的多糖与细胞中果胶、半纤维素等分离开[9-11]，以提高多糖的提取率。为此，该试验以灵芝为原料，复合酶法提取多糖，并优化最佳工艺参数。

果冻是一种利用增稠剂与水为原料制作的休闲食品，深受广大青年人的青睐。在果冻的制作中，灵芝子实体多糖具有一定的凝胶性，当波美度达到65%时冷却凝固。灵芝多糖尚未以增稠剂的用途添加至果冻中，这不仅能够减少明胶的使用量，还能增加产品的稳定性和营养价值。该试验以灵芝为原料，利用质构测定、味觉系统以及感官分析对食用明胶、山楂大枣浸膏等添加量进行优化，为现代休闲食品行业提供新思路，以及后续的灵芝饮料、果冻等的研究和生产提供参考和依据[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长白山林下灵芝(购于延边大阳参业有限公司)；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(购于河南万邦科技有限公司)；葡萄糖、苯酚、无水乙醇、硫酸均为分析纯(购于天津市科密欧化学试剂有限公司)；冰糖、明胶、低聚果糖、β-环糊精均为食品级(购于延吉市西市场)；山楂大枣提取液由延边大学食品研究中心研制。

酶联免疫检测仪(南京华东电子医疗装备有限公司)；数显恒温水浴锅(常州翔天实验仪器厂)；旋转蒸发仪(上海豫明仪器有限公司)；冷冻离心机(德国HERMLE公司)；味觉分析系统(日本Insent公司)；质构分析仪(美国ISENSO公司)。

1.2 方法

1.2.1 复合酶法提取灵芝多糖工艺优化

1) 样品预处理

将灵芝干燥至恒重，粉碎后过筛，密封保存待用。

2) 多糖提取方法

根据丁霄霄等[13]人的试验方法修改如下：称取灵芝样品10.0 g置于容器中，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸馏水浸泡1 h后，称取一定质量分数的果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶(相对底物浓度)加入浸泡液中，50 ℃水浴酶解80 min后，95 ℃下灭酶提取120 min，趁热抽滤至澄清，滤液减压浓缩至50 mL，加入4倍体积无水乙醇，于4 ℃醇沉10 h。5000 r/min离心10 min取沉淀溶解，蒸馏水定容至100 mL。

3) 多糖含量测定

多糖含量以苯酚-浓硫酸法测定，参照屈小玄等[14-15]人的方法并加以改动：以葡萄糖对照品含量c为横坐标(μg)，492 nm波长处测得吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程 A=2.411 9c+0.037 3，相关系数R2=0.995 6。取1 mL提取溶液，相同方法显色后取200 μL滴入96孔板，测得吸光度代入方程计算出灵芝多糖的提取率。

4) 复合酶添加量的确定

①单因素实验：自变量分别为果胶酶(1.5%,2.0%,2.5%,3.0%和3.5%)、纤维素酶(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%和2.5%)和木瓜蛋白酶(1.2%,1.6%,2.0%,2.4%和2.8%)，按照1.2.1 2) 的步骤，保持酶解条件为50 ℃、酶解80 min进行试验，以1.2.1 3) 的方法记录吸光度并计算出多糖得率，分析得到各种酶最佳添加量。

②正交试验：根据上述结果，按照表1进行正交试验设计，保持酶解条件不变进行试验，以确定最佳复合酶配比。

表1 复合酶法提取灵芝多糖正交试验设计

5) 酶解条件的筛选

按照正交试验结果，选用最佳复合酶的比例，对酶解温度及酶解时间进行优化。

①酶解时间的筛选 将酶解时间分别调节为60、70、80、90、100 min，保持酶配比、酶解温度50 ℃不变，通过测定灵芝多糖提取率，确定最佳酶解时间；②酶解温度的筛选 将酶解温度分别调节为46、48、50、52和54 ℃，保持酶配比、酶解时间80 min不变，通过测定灵芝多糖提取率，确定最优酶解温度。

1.2.2 灵芝果冻的开发

参考贾娟等[16-17]人的方法，该试验将以正交设计和感官评价的方法，优化出灵芝果冻的配方。

1) β-环糊精添加量的筛选

参考战旭梅等[18-19]人的方法，采用添加β-环糊精的方法对提取液中的灵芝酸进行包埋，以除去部分苦味和保留灵芝中特有的香味及营养成分，达到试验目的。

准确称量100.0 g灵芝，采用1.2.1.5) 优化后的条件对灵芝进行提取。将提取液浓缩至1 L待用。β-环糊精的添加量设置为7.0，7.2，7.4，7.6，7.8和8.0 g/L分别加入到50 mL灵芝多糖提取液中。

样品倒入洁净的样品杯中，用味觉分析系统(电子舌)分析酸、甜、苦、涩、鲜、咸6个基本味觉[20]。同时，由20名品尝员按照表2评价标准进行感官评价。通过分析两组试验结果确定β-环糊精的添加量。

表2 β-环糊精添加量感官评价标准

2) 口感调配及感官优化

该试验将延边大学食品研究中心研制的山楂大枣浸膏的配料添加至灵芝提取液中进行口感调配，赋予其酸甜的口感。

通过前期试验初步确定了低聚果糖、冰糖以及山楂大枣浸膏的添加量，按表3进行正交试验，自变量为3种辅料的配比，分别添加到β-环糊精脱苦后的灵芝提取液中，以混合液感官为指标，按照表4由20名品尝员进行感官评分，确定最优添加比例。

表3 果冻饮料辅料添加量的正交试验设计

3) 明胶添加量的确定

参照吴佳南等[21-22]人的方法，按上述优化的条件制备混合液加热至60 ℃后，在50 mL混合液中添加不同量的软化明胶(4%，4.5%，5%，5.5%和6%)，混合均匀，放置于4 ℃冰箱内贮存2 h后成型制成果冻。将成品切成1 cm×1 cm×1 cm的正方体，放置于质构仪样品台，以60 mm/min的速度用探头进行40%形变的挤压测定，分别记录硬度、胶黏性以及弹性。同时按照表5标准，由20名品尝员进行感官评价。通过分析2组数据确定食用明胶的添加量。

表5 灵芝果冻感官评价标准

1.3 数据处理

按照表1、3的正交设计进行试验，得到的结果运用SPSS 26.0进行分析，并用Excel对数据进行处理后，Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 复合酶法提取灵芝多糖工艺优化

2.1.1 单因素试验结果

由不同种类酶对提取率的影响可知(图1)。果胶酶添加量为2.5%时多糖提取率最高，达2.22%，添加量高于2.5%时反而下降；纤维素酶添加2.0%时，灵芝多糖最高提取率达到2.92%；木瓜蛋白酶添加1.2%～2.8%时可以看出多糖提取率呈现先上升然后下降的趋势，在添加量为2.0%时，提取率达到最高为2.53%。选择三种酶的最佳用量:果胶酶2.5%、纤维素酶2.0%和木瓜蛋白酶2.0%进行正交试验。

2.1.2 正交试验结果

由表6极差分析结果可知，RA(0.37)>RB(0.23)>RC(0.20)，果胶酶的添加量对灵芝多糖提取率的影响最大。选择最优方案为A2B2C3，即最佳复合酶的配比为果胶酶2.5%、纤维素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%，在此比例下进行试验，灵芝多糖最高提取率达到3.23%。

表6 复合酶配比正交试验结果

2.1.3 酶解条件的筛选

1) 酶解时间的筛选

由酶解时间对灵芝多糖提取率的影响可知(图2)。随着酶解时间的延长，多糖提取率在80 min时最高，随后呈下降趋势。

2) 酶解温度的筛选

由酶解温度对灵芝多糖提取率的影响可以看出(图3)。随着温度的升高，多糖类物质能够更好地从细胞壁释放，48 ℃时灵芝多糖提取率达到最大值,为3.26%。

2.2 灵芝果冻的开发

2.2.1 β-环糊精添加量的确定

由β-环糊精添加量对灵芝提取液感官品质的影响可知(图4，5)。味觉分析系统显示，与对照组相比，灵芝提取液的苦味随着添加量的增加而下降，但酸味以及酸味后味明显提高。当β-环糊精的添加量为7.6 g/L时，灵芝提取液的风味最佳，苦味适中，既适当地掩盖，又不会降低灵芝特有风味。因此，根据味觉系统和感官分析，较适宜的β-环糊精的添加量为7.6 g/L。

2.2.2 口感调配及感官优化结果

低聚果糖、冰糖及山楂大枣浸膏3种辅料的添加量对灵芝提取液感官评价的影响见表7。由表7极差分析结果可知，极差RB(13.3)>RC(8.3)>RA(1.3)，因此改变冰糖使用量对灵芝提取液口感的影响最大。以K值最佳选择最优方案为A2B2C3，评分最佳为92分，此时混合液口感丰富，滋味协调，酸甜可口。即低聚果糖添加量0.2%，冰糖添加量8%，山楂大枣浸膏添加量5%。

表7 辅料配比感官评价正交试验结果

2.2.3 明胶添加量的确定

由表8和图6可以看出，随着明胶添加量的增加，果冻的硬度、胶黏性以及弹性都呈现上升的趋势，质构测定添加量4%的果冻时，极容易被压碎，弹性较差；灵芝果冻的感官评分随着明胶的增加呈现先上升后下降的趋势。因此，较适宜的明胶添加量为5%

表8 明胶添加量对果冻质构特性的影响

3 讨论

3.1 酶添加量对灵芝多糖提取率的影响

单因素试验结果显示，不同种类的蛋白酶对灵芝多糖提取率影响的差异是由于几种酶的作用位点不同[23]。灵芝中的主要成分是几丁质、半纤维素等构成的木素层；多糖所存在细胞壁上的果胶和纤维素等物质，可以通过添加酶促使其破裂，利于多糖的溶出，增加其溶解度。通过分析，酶添加量增多，多糖提取率下降可能是酶浓度趋于饱和或是由于溶出物质过多，杂质含量升高，导致提取率下降。

3.2 酶解条件对多糖提取率的影响

随着酶解时间及酶解温度的提高，灵芝多糖提取率呈现先上升后下降的趋势。提取率降低的原因是由于酶解时间过长而引起了多糖结构发生改变[24]。并且当超过50 ℃时，由于温度过高导致酶丧失部分活性，杂质溶出量不断增大，活性物质分解使多糖提取率逐渐下降。

3.3 β-环糊精添加量对灵芝提取液感官品质的影响

由于灵芝提取液偏苦涩，适口性差，其中呈现苦味的主要物质是灵芝三萜类物质，对肝脏有一定的保护作用，所以应该进行保留，而不适合采用化学方法去除。结果表明随着β-环糊精的添加，灵芝提取液苦味下降，这是由于β-环糊精是一种良好的稳定剂和娇味剂，能够包埋灵芝中苦味三萜类物质，消除异味，改善口感；但酸味以及酸味后味明显提高可能是由于β-环糊精的物理性状所致，其稍有果胶香气，味微甜且带酸味。灵芝提取液的感官评分呈现先缓慢增加然后又稍降低的趋势是由于一定量的β-环糊精可包埋灵芝提取液中的苦味；添加量过多又会造成风味的不协调，使之出现发涩的口感，颜色变得浑浊。

3.3 β-环糊精添加量对灵芝提取液感官品质的影响

明胶是从动物表皮和骨骼中提取的多肽高分子聚合物[25-26]，不仅凝冻效果好而且易被人体消化。通过对果冻质构测定和感官评价分析，明胶添加量过少成品的凝胶性差、质地柔软，缺乏弹性；添加过多时，由于果冻缺乏爽滑的口感，质地偏硬粗糙，并且组织中含有大量气泡，感官评分不高。当明胶的添加5%时，果冻的风味色泽及口感最佳，爽滑细腻，富有弹性。

4 结论

灵芝多糖的复合酶法提取率要远高于单一酶提取，复合酶最佳配比为果胶酶2.5%、纤维素酶2.0%、木瓜蛋白酶2.4%；单因素试验优化提取条件为：48 ℃酶解80 min，此时灵芝多糖的提取率为3.26%；β-环糊精的添加量为7.6 g/L时，提取液的风味最佳，苦味适中；灵芝提取液中加入0.2%的低聚果糖、8%冰糖和5%山楂大枣浸膏时，滋味丰富，具有很好的感官评分；通过对果冻质构测定和感官评价分析，当明胶添加量为5%时，果冻质地光滑细腻。该配方制作的果冻色泽明亮，口感爽滑，酸甜适口，是一款健康的现代休闲食品。为现代休闲食品行业提供新思路，以及后续灵芝的研究和生产提供参考和依据。