荧光PCR标准操作及问题分析

边东生，徐红蕊

（1.南阳市动物疫病预防控制中心，河南 南阳 473000；2.河南牧业经济学院动物科技学院）

很多检验检测机构人员认为，荧光定量PCR 是一项非常简单的检测工作，检验检测人员只要将样品采集完毕，送往实验室处理好，加样品，上机器，等时间，出结果就可以了，但事实并非如我们想象的那么简单。虽然检测人员把试验做了，但是检测结果的准确性是不敢保证的。实践证明，一个准确的检测需要注意的事项和细节非常多，下面笔者就样品采集、实验室操作和常见问题分析三大项进行详细叙述。

1 样品采集

能做非洲猪瘟检测的样品有很多，如唾液样本、抗凝血、血清、淋巴结、脾脏、扁桃体、肺脏、肝脏、肾脏、棉拭子、粪便、流产胎儿等，采集不同的样品，其处理方式方法也不一样，如唾液样品在采集完后最好在2～3 h 内送往实验室，如果不能保证时间，最好将唾液样本放在唾液保存液中送检。如果没有唾液保存液，送往实验室的时间又特别长，这样会对监测结果有很大影响。因为唾液中有很多酶类，很容易降解唾液当中的病毒核酸。除了唾液外，血清样本也是常用于做非洲猪瘟病毒核酸检测的，短时间内可做检测的血清样本常放在4 ℃保存，长时不做则要放在-20 ℃保存。但是如果样品是抗凝血，则不能冻存，这里要注意的是抗凝管不能选择肝素钠，因为肝素钠对于荧光PCR 反应当中所使用的酶有较大的抑制作用，检测结果容易出现假阴性。如果是组织样品，短期内放在4 ℃，长期的则放在-70 ℃即可，如果实验室没有低温冰箱，放在-20 ℃也是可以的。

采集完样品后，样品是否合格也是有依据的。以血清样品为例，样品量较少，样品胶冻样、发生溶血等均为不合格样品。合格的血清一般是均一的，离心后呈淡黄色或者无色。在检测当中常见的不合格样品就是溶血样品，众所周知，溶血是因为红细胞发生破裂导致的血红蛋白渗出。导致溶血的两个重要因素是采集完全血后运输途中发生了剧烈的机械性震动和离心过程中设置的转速过高。因此，为了避免溶血，笔者建议在采集完血液后最好放在室温静置半小时再离心，离心转速不得超过5 000 转每分钟，或者放入冰箱保存，这样既不会出现溶血，也不会出现胶冻。

2 实验室检测

2.1 检测方法

从实验方法上看，非洲猪瘟检测方法有很多，如荧光定量PCR、PCR、ELISA、DNA原位杂交、免疫组织化学、病毒分离鉴定、动物接种试验等，另外，还有一些新的检测方法如胶体金免疫层析试纸条、化学发光技术等。虽然检测方法有很多，但是从生产实际来看，应用最多的还是荧光定量PCR 技术和ELISA 方法，这两种检测方法并不是孤立存在的，而是配合完成非洲猪瘟阳性场的拔点灭源工作的。因为在感染的早期，非洲猪瘟病毒在猪体内复制，并被释放出来，此时的猪唾液、血清中是有很多病毒颗粒的，应用荧光PCR检测方法很容易检测出来，但是到了感染的后期，血清中抗体水平就上来了，病毒颗粒就没有那么多了，用ELISA 检测方法进行检测的时候就会很容易检测出来，但是荧光PCR 检测的时候容易出现假阴性。因此，这两种方法要结合使用才能更好地指导生产。

2.2 检测结果判定

在对荧光PCR 检测结果进行判定的时候，不能单纯地只看机器给出的结果，还要单独分析真实曲线扩增情况。主要从以下流程进行分析。第一步是查看整体扩增曲线，尤其是线性和对数曲线是否正常。第二步是查看阴性对照和阳性对照，看看是否正常。第三步是查看被检测的样品扩增曲线是否正常。第四步是根据扩增情况查看是否需要调整阈值线高度。第五步是根据扩增情况查看是否需要调整基线范围。

2.3 检测结果考评

针对检测结果的考评主要从以下三方面着手，一是查看扩增曲线是否为明显的“S”形扩增曲线，即扩增曲线是否有指数扩增期。二是阳性对照的CT值是否在预期范围内，如果阳性对照过早出现，则很可能是阳性对照被污染或者加样的时候加错了。如果阳性对照出现过晚，则很可能体系内有抑制因素存在或者操作过程有误。三是查看阴性对照是否报告CT 值，如果阴性对照有CT 值，则表明扩增体系被污染，如果无扩增曲线，则主要是阈值线过低导致。

2.4 注意事项

笔者认为，非洲猪瘟检测当中，要注意以下四点，一是在整个检测中要全程使用滤芯滴头。二是标阴、标阳样品必须进行明确标注。三是检测后如果出现疑似阳性样品，必须进行复检。四是整个过程中可能污染或者存在散毒风险的样品、试剂、废弃物要进行高压灭菌。但要注意的是扩增过的PCR 管是不能高压灭菌的，因为PCR 管中存在有大量的PCR 产物，一旦PCR 管在高压过程中出现破裂，那些阳性对照或者阳性样品就会四处扩散，污染整个实验室。

3 荧光PCR检测常见问题及分析

3.1 无扩增曲线或者无CT值

当检测结果出现无扩增曲线或者无CT 值的时候，要从以下五个方面进行分析，第一是软件设置是否有误，如信号采集设置、荧光通道设置是否设置正确。一些国产的荧光PCR 仪通常淬灭基团默认的是“None”，但是进口的荧光PCR 仪的淬灭基团通常需要手动选择。如果信号采集、荧光通道、淬灭基团都没有问题，那就接着往下找原因。第二是仪器硬件故障。如荧光采集、温控系统等是否出现了故障。第三是检测试剂的问题。如引物或者探针是否降解、酶是否失活。第四是核酸提取的问题。如核酸提取失败或者模板错误、漏加。这些也会造成没有扩增曲线或者无CT 值。第五是核酸样本中存在抑制物。样本中PCR 反应抑制物可以分为两类，一类是内源性的，如血红蛋白、脂类、蛋白、多糖等。还有一类是外源性的抑制物，如肝素、抗凝剂、乙醇、胍盐等。

3.2 阴性对照有扩增

阴性对照有扩增通常有三种情况，第一种是阴性对照有较小的扩增，第二种是阴性对照有较大的扩增，第三种是阴性对照和阳性对照一样。这三种情况也间接说明了污染从轻到重的一个过程。实验室污染的来源有很多，如扩增产物的污染、检测样本之间的交叉污染、检测试剂的污染、气溶胶的污染等。要知道，污染比较顽固的，不易去除，尤其是气溶胶污染实验室，短时间内很难去除。因此，在操作过程中，检验检测人员不能存在侥幸的心理，要有较强的防污染意识和较标准的操作要求。另外，实验室要有严格的功能区划分，在检测过程中要设立阴性和阳性对照。如果实验室不小心被污染了，要怎么去处理污染？笔者认为可以用以下方法进行：如实验室保持通风，最好有机械通风设备；使用核酸清除剂进行喷洒和擦拭；10%次氯酸钠喷洒或擦拭；1 mol/L 的盐酸溶液浸泡；紫外线照射；无水乙醇喷雾或者75%乙醇清洗。

3.3 同一样本检测重复性不好

检测重复性不好的主要原因有以下四个方面。一是实验室操作过程中加样不准确，移液器准确度有争议。这种问题可在试验前先对移液器进行校准，然后再做检测。二是仪器硬件的因素，如孔与孔之间的温度差异。三是模板浓度过低，泊松分布导致孔间样本量差异较大，其是对于弱阳性样本，每个试剂盒厂家都不敢百分之百保证每次都能检测出阳性，这很可能是泊松分布造成的。四是荧光PCR反应管均一性较差，也会造成孔与孔之间的重复性不好，这可以通过耗材之间的验证选择重复性较好的耗材即可。

3.4 异常的扩增曲线

出现异常扩增曲线的主要原因有以下四个方面，一是扩增体系内有抑制因素。扩增体系内有抑制因素，扩增曲线就会出现异常走势。二是扩增反应管密闭不严，反应液挥发，扩增曲线出现异常也是比较常见的因素。三是仪器硬件故障。目前市场上大部分实验室都存在国产的荧光PCR仪，国产的荧光PCR仪配件容易老化，尤其是金属钨灯老化很快，荧光PCR仪电压也不稳，很容易造成扩增曲线异常的现象。在更换金属钨灯之后，扩增曲线很快就变得正常起来。四是基线范围设之不当。基线设置过高或者过低都会影响样本检测结果的准确性。

3.5 本底较高或者阈值线较低出现CT值

本底较高，阴性样本出现CT 值这种情况也是比较常见的，如果是本底较高导致的样本出现CT值，我们就要先看一下样本的扩增曲线，如果样本的扩增曲线是“S”形，则样本为阳性，如果样本的扩增曲线没有“S”形，那么这些样本就是阴性。阈值线较低也会出现CT 值，这主要是阈值线设置过低，造成阈值线与扩增曲线有交叉点，才出现CT值。针对这种现象，我们只需要针对阈值线稍做调整即可。□