包含CARD的凋亡相关斑点样蛋白功能特点及其在创伤性脑损伤中的作用

杨家发，朱义通，陆兆丰

（河南科技大学第一附属医院开元院区 急诊科，河南 洛阳 471000）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）由序贯触发随时间－空间动态演进的原发伤及继发伤构成［1－2］。创伤后神经炎症在损伤后几分钟内启动，其特征是相关分子模型（damage－associated molecular patterns，DAMPs）损伤，细胞因子和趋化因子上调和分泌，中性粒细胞和其他髓样细胞浸润，以及胶质细胞激活和白细胞募集［3］。随后产生的抗炎递质和内源性保护剂抑制了体液和细胞免疫激活。除了浸润的外周血细胞外，小胶质细胞也被激活。这些活化的小胶质细胞有助于清除细胞碎片，促进组织重塑，而激活的小胶质细胞也释放各种神经毒性物质，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（nitrogen species，RNS）和兴奋性神经递质（如谷氨酸），这可能加剧神经元死亡。此外，反应性星形胶质细胞的增殖和迁移，以及脑外伤后神经胶质瘢痕的发展损害了轴突的再生［4］。复杂的星形胶质增生和免疫细胞转移到损伤部位可以通过释放神经营养因子促进组织修复和神经再生，也可以通过增加炎症机制加剧组织损伤。包含caspase募集结构域（caspase recruitment domain，CARD）的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis－associated speck－like protein containing CARD，ASC）是一种参与炎症小体组装和焦亡的衔接蛋白［5］。本文就ASC功能特点及其在创伤性脑损伤中的作用进行综述。

1 ASC功能特点

1.1 寡聚化 ASC斑点形成是炎症小体激活的标志，ASC由一个pyrin结构域（pyrin domain，PYD）和一个CARD组成。ASC在低pH和混沌剂溶液中可溶于单体，静息状态下，高能量壁垒阻止其自发性寡聚［6］。炎症小体传感器能够形成一个低聚的PYD簇，作为种子并招募ASC分子形成螺旋状细丝，炎症小体传感器分子的激活导致构象的改变，或通过与共同配体结合使几个炎症小体传感器分子紧密结合，导致PYD自身相互作用。ASC向传感器募集的调节和ASC－PYD线性聚合的干扰触发炎症反应所需的阈值。一旦达到可调阈值，ASC组装成线状细丝和它们的缩合成大分子ASC斑点促进全或无式响应［7］。这些结构是高度调控的，并提供了一个独特的信号平台，以控制caspase－1和可能的其他效应器的活性。传感器分子被认为可以降低ASC齐聚的高能量壁垒，并通过类似朊病毒的传播导致无限制的ASC聚合，以电荷属性为基础的相互作用决定了PYD相互作用的界面属性［8］。1.2 ASC组装形成斑点 ASC斑点在特定时空条件下呈现不同的寡聚化组装，是NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NOD－，LRR－and pyrin domaincontaining protein 3，NLRP3）炎症小体激活的关键步骤［9］。低聚化NLRP3通过同型PYD相互作用招募ASC，并形成螺旋形ASC丝。多个ASC细丝聚合成一个大分子焦点，称为ASC斑点。ASC斑点是前caspase－1招募和激活的位点，可以从细胞中释放出来，在细胞外空间传播炎症，或在其他细胞中由核内体内化和释放，PYD链间界面电荷属性系区域聚合时构象变化的基础，而CARD是斑点形成和下游信号的必要条件［10］。解离常数表明ASC－PYD对NLRP3－PYD有较强的亲和力，ASC与NLRP3的相互作用增强了ASC斑点的形成，导致炎症小体和caspase－1的激活［11］。作为炎症小体下游激活信号，ASC斑点的组装本身并不是caspase－1激活的必要条件。在ASC缺陷细胞中，NLRC4（NLR family，CARD domain containing 4）或NLRP1b的CARD直接招募前caspase－1，或NLRP3招募聚合缺陷ASC突变体，足以激活caspase－1依赖的焦亡［8，12］。前caspase－1的蛋白水解过程，以及IL－1β的释放对典型炎症小体激活物AIM2（absent in melanoma 2）、NLRC4和NLRP3的响应，都依赖于ASC斑点。被激活的神经细胞凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP）／NLRC4环提供了10～12个NLRC4的CARD域，这些域被认为是招募前caspase－1的，但这种排列似乎不足以自动催化caspase－1的激活。这表明ASC斑点以不同的方式招募前caspase－1以促进caspase－1成熟。ASC斑点可能招募更多的比前caspase－1更小的复合物，以达到足够的局部浓度。ASC斑点可能通过许多CARD（如caspase－1）与CARD相互作用招募前caspase－1，或者可能提供多个或少量的CARD聚合体，使体外观察到的caspase－1－CARD丝有核。caspase－1的蛋白水解过程将其催化活性提高了100倍以上，表明ASC斑点可以提供一个可以调节局部caspase－1活性的环境［13］。

NLRP3在炎症小体中扮演核心作用，因为NACHT结构域具有ATP酶活性，这对NLRP3的自我关联和功能至关重要，而LRR结构域被认为通过折叠状NACHT结构域（NAIP，CIITA，HETE and TEP1 domain）来诱导自身抑制［14］。NLRP3通过NACHT结构域间的同型相互作用寡聚。组装后的ASC通过CARD与CARD相互作用招募caspase－1，并使caspase－1接近诱导自裂解和激活［15］。caspase－1聚集在ASC上，在p20和p10之间的连接点自裂解，生成p33（包括CARD和p20）和p10的复合物，该复合物仍然与ASC结合并具有蛋白水解活性［16－17］。CARD和p20之间的进一步处理从ASC释放p20和p10。释放的p20 p10异四聚体在细胞中不稳定，因此终止其蛋白酶活性［18］。NIMA相关激酶7（NEK7），一种已知参与有丝分裂的丝氨酸－苏氨酸激酶，被发现是NLRP3炎症小体激活的关键［16，19］。低细胞数量级的NEK7与NEK9结合进行细胞分裂，在细胞分裂间期NLRP3暴露于初级信号后才与NLRP3结合，NEK7单独不能激活NLRP3，ATP需要与NBD 结构域结合，这会使NEK7的S195磷酸化，使NLRP3采用其活性构象进行寡聚。当NACHT域作为刚体从NACHT域旋转离开时，会出现活性构象，导致NEK7和NLRP3－NACHT域之间的接触点减少。当细胞参与转化生长因子－β激活激酶1（TAK1）依赖的翻译后启动通路时，NLRP3激活不再需要NEK7。在炎症小体激活时，NEK7与NLRP3相互作用增加，NEK7与NLRP3寡聚形成一种复合物，这对ASC斑点的形成和caspase－1的激活至关重要［20－21］。NLRP3炎症小体时间动态演进与蛋白质功能密切相关［22］。别构行为和催化功能强烈依赖于蛋白质动力学和结构域间相互作用，蛋白质结构域动态参与催化、调节和蛋白质组装［23－24］。

2 ASC在创伤性脑损伤中的作用

2.1 参与炎症相关性细胞死亡 创伤性脑损伤后，包含CARD结构域（如NLRP3）或包含PYD结构域（如NLRC4）模式识别受体（PRRs）炎症小体激活。寡聚化PRRs通过使ASC组装成核，从而形成ASC斑点，通过ASC的CARD招募前caspase－1。ASC是caspase－1通过自动处理激活的关键。虽然加工和未加工的活化caspase－1都诱导焦亡，但只有加工的活化caspase－1能有效地将IL－1β、IL－18转化为其成熟形式。炎症小体通过caspase－1、caspase－8及其底物诱导细胞焦亡和凋亡［25］，是继发性脑损伤持续神经功能恶化的分子基础。而前期研究表明，同属泛素化E3连接酶家族的三基序模体包含蛋白22基因敲除后，ASC及其caspase－1表达下调，从而保护神经元免受氧糖剥夺／复氧复糖诱导的凋亡和炎症的影响［26］。

2.2 介导神经血管单元细胞间的细胞通信 脑周细胞－内皮界面的三维超微结构显示：形成血脑屏障的脑血管内皮细胞位于免疫系统与中枢神经系统的交界面，在免疫系统和中枢神经系统的功能整合中发挥重要作用［27］。Nagyöszi等［28］描述了在脑血管内皮细胞（cerebral endothelial cells，CECs）中NOD样受体和炎症小体成分的表达谱和调控。此外，首次证明炎症小体可以在CECs中以丝裂原活化蛋白激酶依赖的方式被激活，从而导致IL－1b活跃分泌。CECs中炎症小体的激活是一种尚未确定的，但可能是血脑屏障调节神经免疫轴的重要机制。通过细胞黏附分子的上调和促炎细胞因子的分泌，包括周细胞和内皮细胞在内的神经血管单元细胞（neurovascular unit，NVU）积极参与神经炎症反应。如前所述，两种细胞类型都可以通过规范途径激活炎症小体，即CECs，而周细胞只能通过非规范途径激活［29］。炎症小体依赖信号通过血脑屏障内皮细胞从大脑向外周传递的直接证据，反之亦然。CECs和脑周细胞的相互激活可能导致细胞因子分泌和血脑屏障破坏，激活周围细胞，启动免疫系统神经炎症，并将全身炎症传播到中枢神经系统［30］。ASC在介导神经血管单元细胞间的细胞通信中的作用有待进一步研究。

2.3 信号衔接、级联放大 创伤性脑损伤激活转化反应性星形胶质细胞，通过DAMPs诱导Toll样受体－核转录因子－κB信号通路［3，31］，通过配体－受体反应，传感器分子招募ASC－PYD纤维的快速形成，将ASCCARD暴露在其表面，创造了大量的前caspase－1招募和激活位点［15］。Shiraishi等［32］研究认为脊髓损伤后，神经元、小胶质细胞／巨噬细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞表达上调，ASC缺失导致小鼠脊髓损伤后炎症细胞因子表达显著减少，运动功能显著改善，ASC通过促炎级联反应在脊髓损伤后继发性损伤的进展中发挥了关键作用。通过ASC斑点的结构和ASC细丝组装机制，ASC丝的形成可能是炎症小体信号的放大机制，这种放大作用有助于在细胞焦亡开始前产生足够成熟的细胞因子。然而，整个ASC斑点组装的结构，包括受体、配体和调控机制仍然缺乏，是否有其他蛋白质参与其形成尚不清楚。具有接头作用的ASC蛋白为完整PYD及CARD结构域提供磷酸化、泛素化、类泛素化修饰位点，ASC铰链区灵活性允许两个半蛋白质结构域同时与其他蛋白质和多肽相互作用，并采用形成每个复合物所需的不同结构域间排列组合模式［13］。

2.4 促炎因子释放 继发性脑损伤持续数小时至数年，神经炎症在NLRP3炎症小体激活中有重要作用，各种串联或独立作用激活NLRP3上游信号，包括钾离子或氯离子的外流、钙离子内流、溶酶体破坏、线粒体功能障碍、代谢变化等［14］。NLRP3招募ASC蛋白经过寡聚、聚集成丝、自我组装成斑点，形成完整炎症小体，促进炎症因子释放及细胞裂解后释放炎症因子。既往研究磷酸化、泛素化、类泛素化调控多集中在NLRP3蛋白，ASC蛋白PYD及CARD结构域位点调控仍是新领域，值得深入研究。

3 总结与展望

创伤性脑损伤，特别是继发性脑损伤，星形胶质细胞促进小胶质细胞和免疫细胞的激活，从而导致持续性神经炎症［32］。其中NLRP3炎症小体为重要角色，NLRP3及ASC各级结构域接受磷酸化、泛素化、类泛素化及翻译后修饰等调控，使NLRP3稳定在一种自动抑制的、不活跃的、但有信号能力的状态［17］。继发性脑损伤持续数小时至数年，持续性神经炎症导致持续性神经功能受损，ASC在炎症小体斑点聚合核心中，从某种意义上认为，NEK7和NLRP3在炎症小体中充当引物作用，ASC的深入研究显得尤为重要，提供了炎症小体抑制剂的化学结构、活性和临床潜力。并有助于利用基于配体或基于结构的方法发现新的NLRP3抑制剂。