脑脊液标志物分析在中枢神经系统白血病中的应用研究进展

王 勉，杨建民，宋志强，唐古生

（海军军医大学第一附属医院血液科实验室，上海 200433）

中枢神经系统白血病（central nervous system leukemia，CNSL）是白血病细胞对中枢神经系统的直接浸润，中枢神经是白血病髓外受累最常见的部位，有研究发现，约26%的成人初发急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者和21%的初发急性非淋巴细胞白血病患者会表现出中枢神经系统受累[1]。近半个多世纪以来，传统化疗方案的改进和各种靶向药物的应用，使白血病治疗的缓解率得到了显著提高，但仍有许多白血病患者出现复发，合并CNSL是最重要的原因，预后往往较差[2-3]。初诊CNSL患者复发率也较高，约占复发患者的20%～30%，占儿童复发ALL的30%～40%，是复发难治的主要原因[2-3]，CNSL患者需要更强的、靶向中枢的治疗措施[2]，早期诊断和治疗CNSL，对于预防白血病复发、提高患者生存率具有重要意义。

目前，CNSL的诊断主要依赖于实验室检查和/或临床症状。但总体而言，目前的实验室检测无法较好地早期诊断CNSL。本文对脑脊液常规检查（脑脊液压力、细胞学涂片和生化指标检测）、流式细胞免疫分型等CNSL实验室辅助诊断方法和单个蛋白、核酸等标志物，以及各种组学标志的研究进展和临床应用进行综述。

1 常规脑脊液细胞学和生化指标检测

目前，诊断CNSL的金标准是脑脊液细胞形态学检查，但结果易受样本采集、制片、主观判读等因素影响，灵敏度低，特别是容易漏诊细胞较少的样本，单次脑脊液形态学检查的敏感性<50%[2]。基于细胞形态学的检测数据显示，成人ALL初诊时仅有5%～10%伴有中枢神经系统受累[2]，儿童则有8.0%～13.4%[2-4]。10%～35%的脑脊液细胞形态学检查未查见肿瘤细胞的白血病患者，后续仍会出现中枢神经系统受累[5]。另外，有60%的CNSL患者没有颅神经麻痹症状和细胞形态学表现[6-7]，因此需要更灵敏的方法来确认脑脊液中白血病细胞浸润情况。脑脊液压力和生化指标异常，对于临床症状不明显或处于疾病早期的病例，常会有提示作用。常用指标包括：总蛋白质、糖和氯化物定量。CNSL患者脑脊液蛋白质的含量会明显增多，主要与病变时血脑屏障通透性发生改变，外周血蛋白质进入脑脊液相关；而糖定量明显减少是由其分解增多所导致的[8]。但这些指标均不具有特异性，仅能辅助诊断CNSL。

脑脊液乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）也常被临床用来辅助判断CNSL。正常情况下，脑脊液LDH活性很低，约为血清中的 1/10，发生CNSL时，白血病细胞浸润到脑膜和脑实质，使脑脊液LDH活性升高，与其他方式联用可提高CNSL的诊断率[9]。正常脑脊液中的β2-MG含量很少，CNSL时白血病细胞无限增殖，肿瘤抗原致敏淋巴细胞、单核细胞，使其大量合成β2-MG。王文静等[10]发现，CNSL患者脑脊液中β2-MG水平明显高于非CNSL患者，单指标阳性预测值和阴性预测值分别为70.76%和68.01%，敏感性和特异性分别为67.34%和72.34%。因此，白血病患者脑脊液β2-MG水平升高可提示中枢神经系统肿瘤浸润可能。然而，脑脊液常规、LDH和β2-MG等指标的检测结果受炎症、感染、出血等多种因素的影响，临床上也常见脑脊液压力和/或蛋白升高或生化指标异常，但疾病进程中始终未见CNSL临床表现的患者。因此，脑脊液常规生化指标检测诊断CNSL的特异性、敏感性仍远不能满足需求。

2 脑脊液多参数流式细胞（multi-parameter flow cytometry，MFC）免疫分型

脑脊液MFC免疫分型较细胞形态学检查具有分析速度快、收集细胞数量多和敏感性高（>0.01%）、特异性好等优点[3，5]，可以更加敏感地预测CNSL的发生[11]，是目前临床诊断CNSL的重要方法，极大提高了CNSL的确诊率[12]。

对于检测CNSL患者脑脊液白血病细胞免疫表型的抗体组合策略，目前国内外尚无统一的标准。通常是各实验室根据不同类型CNSL患者白血病细胞初发免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP）辅以正常发育分化过程中特异性的系列标志，依据实验室流式细胞仪多色通道的数量，组成各实验室特定的多色抗体组合。基本的判断方法是观察脑脊液有核细胞中是否有LAIP，或者表型特点不同于正常分化发育过程中各系列细胞（different from normal，DFN）的异常细胞。由于脑脊液细胞数少，通常仅组成单管或2管多色抗体组合，常用的抗体可参考《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识（2017版）》[13]。HEGDE等[5]采用MFC在51例侵袭性淋巴瘤患者脑脊液中检出11例（22%）阳性，而细胞形态学检查仅检出1例阳性。最新数据表明，采用MFC和/或细胞形态学方法检测脑脊液诊断初诊成人ALL伴CNSL阳性率可达25%，儿童初诊时伴CNSL阳性率为29.0%～34.5%，远高于单用细胞形态学方法[2，14]，MFC联合细胞形态学检查脑脊液，可明显提高CNSL的诊断率[15]。与细胞形态学检查阳性的患者相比，细胞形态学检查阴性但MFC阳性患者脑脊液细胞计数和肿瘤细胞百分比较低，且大多患者无症状[16]。我们在临床工作中采用MFC技术也多次先于临床和细胞形态学检查发现白血病/淋巴瘤细胞中枢浸润。流式细胞术高度敏感，能够在细胞计数非常低的样本中准确检出恶性肿瘤细胞，进而较早地发现中枢神经系统浸润，提示临床进行早期干预。但是，MFC方法学对技术人员血液病理论知识、实验操作及数据分析、样本的即时性等要求比较高。因为中枢浸润肿瘤细胞的免疫表型可能发生改变，引起MFC的漏检，所以当MFC阴性而细胞形态学检查阳性时，并不能排除CNSL，需要临床医生和检测人员综合评估、仔细评判。

3 蛋白质水平的标志物

在疾病发展过程中，白血病细胞向脑组织迁移并与血脑屏障结合，通过分泌多种细胞因子、生长因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）破坏细胞外基质和管腔紧密连接蛋白，从而破坏血脑屏障，并协助形成致瘤的局部微环境[17]。在这一过程中，各种蛋白均可能在脑脊液中出现，并可作为潜在的CNSL的标志物。

MMP是细胞外微环境主要的调节因子，与基底膜破坏有关，与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同促进血管生成和肿瘤细胞转移[18]。在恶性胶质瘤中，脑脊液MMP-9可能是早期检测肿瘤进展的标志，在血液系统中发挥重要作用的是MMP-2和MMP-9，主要降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原蛋白[19]。有学者比较了67例白血病患者（CNSL患者29例）脑脊液中的MMP表达水平，发现CNSL患者MMP-2水平明显高于非CNSL患者和对照者，后两者之间差异无统计学意义，提示MMP-2可能有助于诊断CNSL[20]。原发性中枢神经系统淋巴瘤和非中枢神经系统淋巴瘤细胞分泌型磷酸化糖蛋白1（secreted phosphorylated glycoprotein-1，SPP-1）存在差异表达[21]，急性B淋巴（母）细胞白血病（B-acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者复发时脑脊液细胞中SPP-1蛋白表达水平比初诊时显著升高[22]，提示脑脊液SPP-1或许可以作为预测CNSL的潜在靶标。

脑脊液中VEGF与受体结合，可促进血管生成、增加血管通透性、破坏血脑屏障，进而促进肿瘤细胞的生长与转移。与非CNSL患者相比，伴CNSL的ALL患者脑脊液中VEGF水平明显升高[23]。与血清样本相比，脑脊液样本中的细胞因子和趋化因子可更好地反映CNSL的状态[10]。ROBERTS等[24]发现，趋化因子配体-2（chemokine ligand-2 ，CCL2）具有破坏血脑屏障的作用，有利于白血病细胞进入中枢神经系统，引起中枢神经系统浸润，无论是脑脊液中，还是外周血中，CNSL患者的CCL2均高于非CNSL患者和对照者。CCL2增加与肿瘤中枢神经系统转移相关，可能是CNSL的发生机制之一[25]。ALL患者脑脊液中的可溶性白细胞介素-2受体（soluble interleukin-2 receptor，sIL2-R）水平对白血病细胞的识别能力优于脑脊液白细胞计数，脑脊液sIL2-R临界值为10 U/mL时，诊断敏感性为89.5%，特异性为89.6%，可作为中枢神经系统受累的客观指标。脑脊液sIL2-R水平或可作为诊断CNSL新的辅助指标[26]。

总体而言，关于以上单一蛋白类标志物对CNSL的诊断和预测作用，无论是特异性，还是敏感性，目前国内外的相关研究仍缺乏实质性的进展，它们在临床实践中的价值仍不清楚，尚需要大样本数据对相关指标单用或联用的诊断效能进行更多的临床评价。

4 脑脊液核酸检测

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者FLT3通常高表达，可能与存在FLT3内部串联重复基因（internal tandem duplication of the FLT3，FLT3-ITD）、FLT3/D835Mt突变或者混合谱系白血病串联重复基因（tandem duplication of the mixed lineage leukemia gene，MLL-TD）相关，ALL患者也存在不同程度的FLT3表达[27-28]。OZEKI等[27]发现，CNSL患者脑脊液FLT3 mRNA阳性率及表达水平显著高于完全缓解组和对照组非肿瘤患者，非CNSL患者脑脊液中FLT3基因表达多为阴性。脑脊液FLT3阳性组单个核细胞数高于阴性组，LDH水平也更高，提示脑脊液FLT3表达与CNSL发生密切相关[28]。脑脊液WT1 mRNA水平与CNSL以及血液学复发也有很强的相关性[29]。尽管不能覆盖所有CNSL患者，但脑脊液中FLT3和WT1表达水平的改变或可作为CNSL更敏感的早期诊断和疗效判断指标。同时采用MFC和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测疾病特异性的免疫球蛋白重连基因IGHR重排和/或T细胞受体基因TCR重排评估ALL患儿脑脊液白血病浸润情况，并与传统的细胞形态学检查进行比较，发现PCR检测基因重排诊断CNSL的阳性率可达60%，MFC检测的阳性率为46.6% ，细胞形态学检查的阳性率仅为22.2%，MFC和PCR诊断效能是细胞形态学检查的2～3倍，提示脑脊液疾病特异性基因重排核酸检测可作为ALL患者早期中枢浸润敏感的诊断方法。然而，基因重排检测需要设计个性化疾病特异性的PCR引物，耗时且检测成本高，也需要足够量的脑脊液和白血病细胞，技术要求高，而且较容易出现假阴性结果，因而临床易见MFC阳性但PCR不能检出的情况，需要综合判断[30-31]，因此该技术临床应用尚不广泛。

游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是存在于血液、尿液、脑脊液等体液中的细胞外DNA。正常情况下，脑脊液cfDNA水平较低，中枢浸润白血病/淋巴瘤患者脑脊液中可检出肿瘤特异性的DNA——循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及其相关突变，辅助CNSL的诊断，可以弥补细胞形态学检查和MFC免疫分型的不足。约85%的初发中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）患者携带MYD88（L265P）突变。数字PCR检测脑脊液细胞DNA或cfDNA MYD88（L265P）突变诊断CNSL有极高的特异性[32]。有研究对中枢淋巴瘤组织靶向下一代测序（next generation sequencing，NGS），对获得的突变位点，在外周血和脑脊液中采用数字PCR进行个体化突变位点检测，发现脑脊液cfDNA检出率及突变频率比血浆更高，且脑脊液检测cfDNA与MFC免疫分型结果吻合度好[33]。对脑脊液行全外显子测序，进一步证实了脑脊液ctDNA诊断中枢神经系统淋巴瘤的高特异性，在系统性非中枢淋巴瘤患者脑脊液中均未检测到ctDNA，且CNSL患者治疗后，脑脊液MFC检测阴性的患者，部分仍可检出ctDNA[34]。

因此，基于普通PCR对脑脊液浸润细胞DNA和/或RNA，以及cfDNA中肿瘤特异性突变位点进行数字PCR或NGS检测，可能是敏感性更高的原发或继发中枢神经系统淋巴瘤检测方法。

5 组学检测

ROY等[35]采用基于液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的方法，在中枢神经系统B细胞淋巴瘤与其他良性疾病患者的脑脊液中差异定量和鉴定了500种蛋白质，将两者进行了有效区分。GUO等[36]使用LC-MS/MS对比ALL患儿和对照者的脑脊液，鉴定出51种差异表达蛋白质，并发现这些差异表达蛋白质并不是随机的，相互之间有复杂的互动网络，其中多种蛋白质都与癌症有关，提示白血病细胞相关蛋白可以出现在脑脊液中。MO等[37]采用LCMS/MS对6例ALL伴CNSL患儿治疗前后的脑脊液进行蛋白质组学分析，并绘制了CNSL患儿脑脊液的蛋白质组学图谱，量化了化疗前后发生变化的蛋白质，证实这些蛋白质可作为ALL疾病进展标志物以及CNSL新的治疗靶点。然而，上述研究[35-37]样本量均较小，观察周期相对较短，需要扩大样本量，并延长观察时间，进一步验证这些改变的蛋白质在CNSL诊断中的作用。

代谢组学主要通过色谱、质谱与核磁共振技术，以及几种技术的联合使用，定性或定量分析内源性小分子代谢物，继而快速、系统、全面地检测各种因素导致的细胞生理或病理性代谢物变化，为疾病的早期诊断与预后监测提供强有力的支持。目前，对血液病患者脑脊液代谢组学的研究较少。对脑原发或继发中枢淋巴瘤、肺癌脑转移或未转移患者的脑脊液进行代谢组学的研究发现，脑实体瘤患者与非脑实体瘤患者脑脊液在多种氨基酸和嘌呤代谢通路上存在显著差异[38]。脑原发中枢淋巴瘤和肺癌脑转移均存在植物鞘氨醇和L-谷氨酰胺水平的上调。植物鞘氨醇水平升高可能反映了相对较高的肿瘤细胞增殖速率和脂质膜增加重塑；L-谷氨酰胺增高可能与脑肿瘤快速增长所需的高能耗相关[39]。与脑原发中枢淋巴瘤患者相比，继发中枢淋巴瘤患者脑脊液中5-氨基咪唑上调，但肌醇磷酸、高半胱氨酸和戊基蛋氨酸下调，可以反映出2种疾病之间固有的病理生理差异，或可用于2种疾病的鉴别诊断[40]。有研究发现，采用8个代谢产物的组合，可以鉴别诊断肺癌脑转移与非脑转移，曲线下面积为0.91；6个代谢物鉴别诊断继发中枢淋巴瘤与脑转移的曲线下面积为0.87；提示代谢组学可区分不同脑肿瘤患者脑脊液的代谢物差异，初步显示出其诊断不同类型脑肿瘤的巨大潜力[40]。本课题组正在进行的研究结果显示，脑脊液代谢组学检测可以有效辅助区分ALL患者中枢浸润情况，且其确诊CNSL的时间可能更短（数据尚未发表），提示采用脑脊液代谢组学进行CNSL的诊断和鉴别诊断，具有明确的临床可操作性和实际的临床价值，值得进一步扩大样本量进行临床研究和推广应用。对相关特异性代谢产物的进一步回溯分析，有助于从代谢角度理解肿瘤中枢浸润可能的新机制。

6 总结

血液系统恶性肿瘤中枢神经系统受累患者临床预后较差。脑脊液肿瘤细胞形态学筛查和MFC检测是目前诊断CNSL的主要方法，但其敏感性、特异性尚不能满足临床需求。蛋白标志物、核酸分析，各种组学评估临床研究的开展有望在脑脊液样本中发现新的CNSL标志物，并可能更早提示CNSL的发生，但仍然需要更多的临床研究数据支持。未来研究不仅要着眼于发现新的和更敏感、更特异的脑脊液分析方法和新的标志物，还要通过多中心的大样本临床试验来验证已经发现的标志物、代谢物的临床实用性。