奶中风味物质检测技术研究进展

迟雪露，刘慧敏，叶巧燕，郑楠，王加启

（1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室，北京100193；2.新疆农业大学 动物科学学院，乌鲁木齐830052）

0 引言

食物风味被定义为通过感知食品气味，滋味的刺激而产生的信号，整合或相互作用后产生的，短时的综合的生理感觉[1-3]。这种感觉是由复杂的挥发性分子混合物所触发的，这些组分通常是痕量浓度（ppm或ppb）的。奶及奶制品是营养均衡、健康饮食的重要组成部分，中国奶产品消费量逐年提升，高端乳制品的消费潜力巨大，在保证营养品质的基础上，消费者对奶产品感官品质的越发关注。奶产品的外包装、滋气味及其质地等对消费者的选择具有决定性的作用。奶的滋气味组成较为复杂，带给人的感觉并不是单一组分香气强度的加和，还需要考虑化合物的浓度、阈值、以及各组分之间的协同或者拮抗作用[4-5]。研究奶的特征风味物质及建立评价体系，对于保证奶产品感官品质和改善消费体验，具有十分重要的意义。通过对风味物质检测及分析方法的总结，以期为多种分析方法联用，深入探索奶产品感官品质提供参考。

1 奶中风味物质及影响因素

1.1 奶中风味物质

奶中挥发性的风味物质主要为醛、酮、酯、含氮、含硫以及萜烯类化合物等。这些组分与奶的特殊风味密切相关，会赋予其青草气味、花香味、果香味、焦糖味、黄油味、蒸煮味、中药味及其他刺激性气味或异味等。在对奶产品风味进行分析的时候，除了化合物的浓度，还需要关注各组分的气味阈值，尽管有些化合物在奶中的含量很低，由于其气味阈值较低，也会对奶的整体香气产生较大影响。

有研究表明，低浓度的醛含量与草本香气有关，但在较高浓度下，会产生令人不愉快的异味，并且基于该类化合物较低的气味阈值，醛类化合物被认为是奶中重要的风味组分[6]。

牛奶中天然存在的饱和脂肪酸的β-氧化、脱羧或β-酮酸脱羧所产生的酮类化合物对奶整体风味也是十分重要的[7-8]。脂肪酸是具有奇数碳原子的甲基酮的前体物质，例如2-戊酮和2-庚酮[9]。低分子量的甲基酮（如丙酮和丁酮）主要来自奶牛的新陈代谢[10]。二乙酰由于其典型的黄油味而引起了关注，二乙酰可以从草料中转移到牛奶中也可以通过某些奶中化合物的酶促反应形成[11]。

含硫和含氮化合物也是奶中特征性组分，如硫化氢，甲硫醇，二甲基硫醚，二硫化碳，二甲基二硫醚，二甲基三硫醚，二甲基砜，2-乙酰基-1-吡咯啉，苯并噻唑，2-异丁基-3-甲氧基吡嗪，吲哚和粪臭素等[12-14]。吲哚气味比较特殊，并且阈值低，当其含量很低时特征是带有茉莉的淡淡香气，而高浓度吲哚则带有令人不愉快的粪便味[15]。

萜烯是植物的二次代谢产物，单萜烯和倍半萜烯可以很容易地从草料中转移到乳脂中，该类化合物通常具有水果味，草味或树脂味，会在一定程度上影响奶风味，与干草相比，它们在鲜草中的含量更高[16-17]。有研究表明萜烯化合物尤其是半萜烯可以帮助表征从不同牧草，不同季节或不同地理区域饲喂的反刍动物的奶中获得的奶产品[18-19]。

新鲜牛奶中已鉴定出多种酚类化合物，例如苯酚，邻甲酚，间甲酚和对甲酚，2-乙基苯酚和4-乙基苯酚，百里酚和香芹酚等[20]。该类化合物被认为主要来自饲料，也可能来源于细菌的氨基酸分解代谢和消毒剂的污染[21]。低含量的酚类化合物会散发出令人愉悦的甜味，轻微烟熏味或焦糖味，但当其含量较高时，会引入刺激性气味或药味等异味[22-23]。

1.2 影响奶风味的因素

对奶及奶制品风味产生影响的因素较多，例如奶牛饲喂系统、挤奶过程、奶产品加工工艺、包装材料以及储运条件等每个环节都会产生一定影响。

高品质原料奶的生产对于奶制品的加工及销售至关重要，优质牛奶的生产从牧场开始，因为牛奶的风味和品质在后期加工阶段无法提高[24]。原料奶越优质，由此加工制得的奶制品就会越好，因此加强对生乳品质的监测有利于保障优质奶产品的生产。除年龄，健康状况和泌乳阶段等因素外，奶牛品种和其他遗传特征对牛奶风味也有重要影响[25]。奶牛的喂养系统也会影响牛奶的感官品质，如饲料类型、草料保存方法、草料植物组成以及日粮配方等[26-29]。在挤奶过程中，挤奶设备、挤奶工人、整个农场的卫生条件以及牛奶的收集和存储都会对其感官品质产生影响[26]。

奶产品的加工工艺对其感官品质影响较大。当热处理加工变量偏离适当的条件或施加更严格的温度或时间条件时，易出现令人不愉快的味道。和巴氏杀菌乳相比，超高温灭菌的工艺会产生强烈的硫化氢，甲硫醇，甲基二硫化物，二甲基二硫化物，二甲基三硫化物，二甲基砜等含硫化合物[36]。有研究表明苯并噻唑、δ-内酯和己醛等是典型的热诱导化合物，可能会赋予产品更浓郁的蒸煮味或卷心菜的味道，从而降低消费者接受度[35-37]。风味是动态变化的，在存储过程中，挥发性化合物的浓度会逐渐降低，各组分之间会持续发生一系列的化学反应，陈腐味、苦味和蒸煮味会一定程度的增加，使牛奶的整体品质缓慢下降，而精确控制加工条件可以减少这种风味缺陷的发生程度[38-40]。

此外，包装材料也在很大程度上影响了奶中的风味。Zygoura等将鲜牛奶包装在透光容器中，然后储存在有光的陈列柜中时，挥发性化合物2,3-辛二酮的含量显著增加，奶中会出现典型的蘑菇味和金属味等光氧化的异味[30]。Vassila等人研究表明某些脂肪酸和氨基酸作为底物，光和核黄素参与光诱导的化学反应，会产生油脂腐败味、纸板味和金属味等不良感官描述[31]。除此之外，甲硫醇，二甲基硫醚，二甲基二硫醚，戊醛，己醛，2-丁酮和1-辛烯-3-酮等也被鉴定为光活化组分[32-34]。

2 挥发性组分提取方法

对于挥发性组分的提取方法有很多，顶空固相微萃取（Headspace-Solid Phase Micro-Extraction，HSSPM E）、同时蒸馏萃取（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）和溶剂辅助蒸馏萃取（Solvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE）是目前广泛用于表征牛奶中的香气组分的前处理技术。不同的前处理方法会直接影响结果的可靠性和准确性，因此需要全面的考虑不同提取手段的优势及缺点，针对于不同的研究目的，选择合适的前处理方法。

2.1 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取是奶及奶制品风味分析中最为广泛应用的前处理手段，该方法是一种静态顶空技术，用于从非挥发性食品基质中快速提取和浓缩挥发物[41-44]。HS-SPME包括两个不连续的步骤：一是从样品基质中溶入吸收到熔融石英纤维中，该纤维在外部涂有合适的固定相。二是将分析物转移到色谱系统中进行分离。该方法可以减少制备时间、溶剂使用和处理成本，在提取低分子量和高挥发性化合物方面更有效，对酯和高挥发性化合物的回收率更高，被广泛应用于多种食品的风味分析中，如橙汁[42]、大豆[43]、橄榄油等[44]。Vazquez-Landaverde等人使用HS-SPME结合气相色谱-脉冲火焰光度检测法对奶中挥发性硫化物进行定性定量分析，研究了生乳高压处理和热处理带来的影响，热处理倾向于促进甲硫醇、硫化氢、甲基酮及醛类化合物的合成，而高压处理促进硫化氢和醛类化合物的生成[37]。并通过计算气味活性值的比较，提出甲硫醇和二甲基三硫化物市UHT牛奶中主要的含硫气味贡献物[40]。但是该方法涉及到两个平衡系统，会对挥发性组分的回收率产生一定程度的影响。

2.2 同时蒸馏萃取

SDE是一种从复杂食品基质中分离挥发物的方法，通过同时加热样品液相与有机溶剂至沸腾来实现，蒸馏和提取同时进行，消耗溶剂量较少，香气成分到浓缩效率高，常用于奶酪、发酵奶或奶粉等产品的风味分析[45]。李宁等人使用SDE结合GC-MS在新疆发酵骆驼奶中鉴定出66种挥发性化合物[46]。

该方法对于中等至高沸点的醛、酮类组分的萃取回收率较高。但是可能会因为操作温度高，使获得的香气组分有失真现象，为提取的香气带来“蒸煮味”等气味，影响后续的风味分析。

2.3 溶剂辅助风味提取

SAFE是一种将蒸馏单元与高真空泵相连接，在高真空和极低温度条件下，完成挥发物的蒸馏、萃取和冷凝的方法，在此过程中，可以从奶制品[46]，水果[47]，咖啡[48]等新鲜食品中分离出挥发物。该方法对极性高的风味物质有较高的回收率，能得到较为真实可靠的风味提取物。不足之处在于对复杂食品基质中痕量挥发物的提取不充分，需要准备大量样品，且必须将获得的有机相（挥发物提取物）在进行气相色谱-嗅闻分析之前，将其浓缩在韦氏分馏柱（Vigreux）色谱柱中，这会导致高挥发性挥发物的损失。

3 分离鉴定手段

奶风味是由于特定基质中挥发性组分的复杂混合物所构成，多数化合物的浓度非常低，而且牛奶基质的异质性使分离变得困难。随着色谱柱能效的提高，检测器灵敏度的精进，使用气相色谱进行分离是目前最常用的分析方法。但是基于不同的研究需求，气相色谱与其他分析仪器联用，已经逐渐成为结构分析中的有力工具，如气相色谱与质谱联用、气相色谱与嗅闻仪联用、与离子迁移谱联用等。通过多仪器方法联用对奶中风味组分进行解析是奶产品感官品质评价的一个重要手段。

3.1 气相色谱-质谱联用

常用的挥发性风味物质的定性方法主要有质谱定性、保留指数定性、标准品定性和气味描述定性，在风味分析上通常认为3种及以上的方法同时定性结果较为准确。质谱定性是利用气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）将样品中分离的挥发性组分与NIST谱库进行比对，同时结合人工手动谱图解析进行定性。定量方法主要是内标法、外标法及面积归一化法等。贾伟等人使用GCMS、UHPLC/ESI Q-Orbitrap两种方法，对牛奶、奶制品、香精香料中挥发性组分进行分析鉴定，建立Fisher判别模型，用于预测是否向奶制品中添加调味剂[49]。Sfakianakis和Tzia结合SPME和GC-MS，对比使用超声均质化和传统压力均质化处理牛奶，对制成的酸奶产品进行评价，感官特征差异显著，超声处理后某些羧酸、醛和酮类化合物组分浓度增加，一定程度上导致风味变差[50]。Karagul-Yuceer等对Chevre山羊奶酪的风味进行分析，描述型感官评价表明奶味及特征性油脂味/动物味是其特征风味，结合GC-MS和GC-O定性定量分析，结果表明2,3-丁二酮（黄油味）、1-辛烯-3-酮（蘑菇味）、邻氨基苯乙酮（葡萄味）、内酯（椰子味）、辛酸（刺激性酸味）以及4-甲基辛酸和4-乙基辛酸（油脂味）是山羊奶酪中高强度的风味活性物质，随后通过香气重组和缺失分析证明了4-甲基和4-乙基辛酸两种化合物是特征油脂味/动物味的可能来源[51]。

3.2 气相色谱-质谱-嗅闻

气相色谱-质谱-嗅闻（Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Olfactometry，GC-MS-O）是一种结合了气相色谱-质谱和气相色谱-嗅闻的技术，将人的鼻子作为检测分析物的气味强度仪器，与GC-MS分离鉴定挥发性混合物同时进行，实现了气味活性化合物检测的同时获取其化学结构信息。该技术在食品风味分析中的应用非常广泛，可以用于表征气味活性成分，即影响食品气味特征的代表性化合物[52-54]。

样品的挥发性提取物通过气相色谱的毛细管柱分离后，流出物以合适的分流比进入检测器和嗅闻端口，在质谱定性定量分析的同时，结合试验员鼻子对挥发性物质的进行主观检测，致力于对气味描述、强度等随时间的变化情况的研究，针对于一些高气味强度的挥发性化合物的浓度太低GC-MS无法检测到的情况，该方法是一种较好的补充[52]。

时间-强度法、强度法、稀释法及检测频率法等常用于鉴定和排序样品中香气活性化合物的贡献。香气活性值（Odor Activity Value,OAV）是建立在GC-MS精确定量结果的基础上，结合嗅闻评价的结果，用于表征挥发性香气组分在特定食品基质中香气贡献大小，即香气组分在样品中的浓度与香气组分的香气阈值的比值，具有较大OAV的香气组分被认为是对样品整体风味贡献更大。OAV值已被广泛用于确定饮料[53]、白酒[54]、水果[55]，奶酪[51,56]，精油[57]和葡萄酒[58]等食品中重要的芳香活性化合物。

在进行嗅闻评价和OAV计算的过程中，都是对经过色谱柱进行分离、脱离原基质体系后的单个香气组分的香气贡献大小进行独立计算，这些被鉴定为关键香气组分的化合物，在原样品基质中共存时，是否会重现样品的典型香气特征，需要我们在关键成分筛选和香气贡献评价的基础上，进行香气模拟体系重组，通过评价模拟体系与真实样品的相似度对关键组分进行核实和验证[51]。通常会使用样品中定量的香气活性组分（OAV＞1）制备香气模型，根据OAV从低到高逐一缺失，以获得一系列不完整的香气模型，与原样品进行感官品质比对评价，进行进一步验证[51,59]。

田怀香教授使用HS-SPME方法对中国奶扇中挥发性组分进行富集，使用GC-MS和GC-O对其中香气成分进行分析，鉴定出71种香气化合物，检测出31种气味活性化合物，同时结合对奶扇样品感官评价、香气重组和缺省分析的实验结果，确定了丙酸和2-壬酮（奶酪味），丁酸（陈腐味），辛酸和壬醛（脂肪香气）和己酸乙酯（果香）为主要香气化合物[60]。Fuchsmann等人对Tilsit奶酪的气味特征进行解析，结果表明丁酸、3-甲基丁酸和2,3-丁二酮和黄油气味密切相关，甲硫醇、二甲基硫、3-甲硫基丙醛主要贡献了奶酪的气味[61]。

3.3 气相色谱-离子迁移色谱

气相色谱-离子迁移色谱（Gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry，GC-IMS）是将气相色谱高分离能力和离子迁移色谱快速响应的特性结合，使用气相色谱将待测样品中的挥发性组分进行初步分离，通过离子迁移色谱进行二次分离的方法。目前该技术已经广泛应用于药物检测、疾病监测、环境保护以及食品风味分析等领域。

该方法可用于检测不同基质中痕量挥发性有机化合物和半挥发性有机化合物的方法，根据中性缓冲气体在电场中的迁移率，在常压下对离子有快速响应和高灵敏度的优势，并且检测限低、分析时间短，可常压工作[62]。虽然IMS在分析方面表现出巨大的潜力，但是在食品风味分析领域，基质交叉的敏感性问题，水分含量等问题会导致样品在一定程度上被基质化合物所掩盖，对迁移率、离子浓度以及检测结果产生一定影响[62-63]，由于GC-IMS没有类似NIST谱库的数据库，这也是限制其应用的原因之一。Janneth等人通过使用GC-IMS对乳酸菌菌株释放的挥发性化合物进行分离鉴定，并进一步建立指纹图谱，可以结合主成分分析识别和区分不同的菌株[64]。有学者通过HS-GC-IMS对两种干燥工艺加工的牦牛奶粉中挥发性化合物进行检测，共鉴定出17个化合物，包括醛类、酮类、酸类、萜烯类、酯类和杂环类，讨论了不同干燥工艺对牦牛奶粉风味的影响[65]。李娟等人采用GC-IMS技术对不同品牌牛奶样品中挥发性化合物进行分析，共鉴定出29种化合物，结合主成分分析结果，对不同类别或不同品牌奶产品区分效果良好[66]。

4 感官评价

感官科学的发展与应用已经逐渐深入到食品领域，现代化的生产过程中需要监测的产品参数和品质指标越来越多，企业成立专门的品评部门，根据需求通过结合多种感官分析方法（定量描述分析、时间-强度感受分析）、量化方法（线性表度、量值估计）、品评特性（差别型检验、描述型分析、偏好性分析）对产品的感官品质进行评价[67,69]。描述性感官分析方法已经广泛应用于乳制品评估中，以识别和测量最能表征其感官特性的那些属性[67-68]。感官评价是对视觉，嗅觉，味觉，触觉和听觉所感知的刺激反应的量化，主要分为完全主观的人工感官评价和借助仿生仪器的智能感官分析。

4.1 人工感官评价

定量描述型分析能直观的看到产品各感官属性评分，获得产品感官感受信息量最大、用途最广泛的方法[69]。在感官描述分析过程中，风味的描述语和感官属性的评价尺度是主要评价手段。感官评价的试验员前期需要接受一定的训练，通过反复对香气化合物的标准品进行嗅闻评价，使评价员的判断能力更加稳定准确。在感官评价过程中，以参比样为标准，通过选择合适的词汇进行描述，评价相应的感受强度，得到网状风味剖面图，从而较为直观的发现产品的特征风味及感官缺陷[69]。根据需求选择性的结合多元统计分析，比较产品间风味差异，可以更有效的分析产品定位与优势[69-70]。

香气偏好型分析主要是针对消费者偏好趋向进行研究，面对的是消费者的需求。食品感官品质的评价在一定程度上是基于消费者的主观评价，与个人情况、时间、地点等因素有关。通过线性表度和描述型分析，结合偏最小二乘回归和偏好映射等方法对感官评价结果进行分析，是研究消费者对产品感官特征偏好的常见研究方法[69-73]。

国内已经颁布了多项感官分析相关标准，其中大部分都是对国际标准的直接引用[69]。

4.2 智能感官分析

相较于主观的人工感官评价方法而言，智能感官分析系统作为一种通过仪器模拟人感知器官的研究设想被提出，具有仪器的稳定性和准确性，在一定程度上弥补了感官评价的局限性，被广泛的应用于食品领域，但是对于综合属性的区分不如人工感官评价灵敏、真实[74]。

4.2.1 电子鼻

电子鼻是由性能彼此重叠的多个化学传感器(即气体传感器阵列)和适当模式识别方法所组成的，可以识别简单和复杂气味的仿生学仪器,它检测到的是样品中挥发性成分的整体信息即“指纹信息”。它不仅可以测定不同的气味信号，而且还可以将这些信号与经过训练后建立的数据库中的信号加以比较，进一步判断识别分析[74-75]。目前已经商业化的电子鼻有很多种，常见的传感器类型有金属氧化物传感器、导电聚合物传感器和石英晶体谐振传感器等，仪器配置的传感器数量6到40个不等。

王蓓等人通过电子鼻成功区分了三种天然奶味香精和两种人工合成的奶味香精[73]。Biolatto等人结合SPME-GC和电子鼻对全脂奶粉气味特征进行检测，结果表明夏季生产的全脂奶粉中己醛含量较高，秋冬季节二甲基硫醚和正戊醛含量较高，丁酸在秋季和春季之间差异显著[76]。

4.2.2 电子舌

电子舌与电子鼻相似，是一种对味道综合信息进行评价的手段，电子舌模仿哺乳动物舌头对液体味觉信息进行检测，用类脂膜作为味觉传感器。传感器阵列浸入液体试样中，对液体样品进行响应，然后信号传递给模式识别系统，经初步处理和模式识别，得到反映样品味道特征的结果[74]。借助于智能感官技术，从传感器响应曲线上可以看出不同传感器对样品的响应情况。通过对样品进行主成分分析、聚类分析以及偏最小二乘回归分析等，可以区分样品，直观的看出各样品之间的相似性和相异性。

Dias等人使用电子舌对山羊奶中掺假牛奶进行检测，区分效果良好，5个基本传感器响应情况有差异，其中酸、咸和鲜味物质敏感性较高，苦味和甜味两个传感器的响应程度较低[77-78]。有学者应用电子舌对未密封的巴氏杀菌乳进行检测，同时测定样品菌落总数和黏度指标，结果表明电子舌可以对不同保存时间的牛奶样品清晰分类，并且可以对黏度和菌落总数进行很好的预测[78-79]。Madiha等人通过组合使用电子鼻和电子舌，对巴氏杀菌奶的储存时间和品牌进行准确分类[79]。

5 结论

本文从奶中风味物质的前处理手段、分离鉴定技术以及感官评价方法几方面进行总结。随着仿生仪器出现和检测技术的进步，主观感官评价和客观仪器分析相结合，使得我们对奶中挥发性风味物质的解析有一定的进展，对于优化加工工艺及控制产品质量等方面具有重要意义。

为满足消费者进一步的需求，奶风味化学研究还需要更加深入，因此需要更多高通量的检测技术作为支撑，改善针对不同奶产品的前处理方法，提高检测技术的准确度和精密度。除风味组分的贡献外，还需要对其生成途径、反应机理及交互作用进行探讨。建立系统、快速、有效的评价和监测体系，对原料奶及货架期内奶制品的风味进行质量控制和监测，保证优质奶及奶产品的固有风味，以消费者喜好为导向，提升奶产品感官品质，改善消费体验，从而推动我国奶业发展。