干性年龄相关性黄斑变性免疫学机制的研究进展

孟 欢，金 明

•KEYWORDS:age-related macular degeneration; immune molecule; pathogenesis

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种致盲性眼底病变，可导致中心视力不可逆的丧失，是目前发达国家中老年人失明的主要原因，预计至2040年全球ARMD患者将增至约2.88亿[1]，造成严重的经济及社会负担。ARMD根据临床表现可分为渗出型(湿性)及萎缩型(干性)两型，其中干性ARMD的患者比例约占所有ARMD患者的85%以上[2]，早期以黄斑部色素异常与玻璃膜疣生成为主要表现，而逐步进展至密集或融合的玻璃膜疣乃至晚期视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)局灶性萎缩、光感受器丧失，也称为地图样萎缩(geographic atrophy，GA)[3]。目前ARMD具体的发病机制尚不完全明确，越来越多的研究表明ARMD是一种多因素导致的退行性眼底病变，涉及遗传和环境因素之间的相互作用[4]。但人们普遍认为炎症与免疫反应在ARMD的发病中起到关键作用[5]，近年来有证据表明补体、模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)、炎症小体及多种细胞因子等免疫分子参与了干性ARMD的发病机制。因此，本文将就上述免疫分子在干性ARMD发生发展过程中的作用进行综述，以探讨关于干性ARMD的免疫学发病机制。

1补体系统

补体是人和脊椎动物血清与组织液中一类经活化后具有生物活性、可介导免疫和炎症反应的蛋白质，补体系统是一个复杂的固有免疫监视系统，在防御病原体和维持体内平衡方面发挥重要作用[6-7]。补体蛋白以级联方式协同作用，在不同情况下通过三种不同方式启动—经典途径、凝集素途径及旁路途径。补体在体内效应十分广泛，参与调节感染及炎症反应、免疫基因的表达、免疫稳态的维持等多项病理生理过程，几乎参与了免疫反应的每一步，是连接固有免疫与适应性免疫的重要桥梁[8-10]。

研究发现，补体基因的多态性与ARMD易感性的关系密切。补体因子H(CFH)是最早被发现与ARMD发病相关的补体因子，CFH是补体旁路途径的主要抑制剂，抑制了C3转化酶的形成和活性，可增强RPE抗氧化应激的能力，但其基因Y402H的多态性降低了CFH中和氧化脂质的能力，显著增加了患ARMD的风险[11-12]。随后，补体因子B(CFB)、补体因子I(CFI)、C3、C5等多种补体基因的单核苷酸多态性与ARMD易感性的关联也逐渐得到证实[13-14]。一项包含53 774例ARMD患者和56 973名健康对照者的Meta分析结果显示，C2、CFB和CFH的部分基因多态性对ARMD的发展具有保护作用，而C3的基因多态性表现为ARMD的高危因素[15]。

补体蛋白自身也参与ARMD的病理过程，补体系统有规律的活化对RPE有一定保护作用[16]，其异常激活是ARMD的关键发病机制。Nashine等[17]研究发现ARMD患者的RPE中补体抑制因子的基因和蛋白表达显著降低，而激活因子水平显著升高。Toomey等[18]发现向干性ARMD模型小鼠全身注射C5a抗体，可抑制单核巨噬细胞向RPE的募集，但无法改善小鼠眼底的ARMD样改变，提示C5a参与干性ARMD的病理过程，但此过程同时还包含多种因素驱动。目前在玻璃膜疣中已检出CFH、CFB、C3、C5、C6、C7、C8、C9等多种补体蛋白成分，表明在干性ARMD视网膜上存在由补体系统介导的炎症反应[19]，而CFH、CFB及C3等因子的存在说明了补体旁路途径的激活在其中发挥了明显作用[20]。不断发生的补体旁路途径的激活，导致膜攻击复合物(MAC)在脉络膜毛细血管和RPE上的大量沉积[21]，MAC是三条补体激活途径的共同末端通路，是补体溶细胞生物学效应的效应复合体，可导致细胞死亡。Mullins等[22]对117例青年、老年供眼进行MAC含量检测，发现MAC含量随年龄及患ARMD显著增加，在ARMD患眼中发现硬性玻璃膜疣中除MAC外还存在MAC抗体，而较大或已融合的玻璃膜疣中则未检出MAC抗体。基于此，多项作用于补体系统的干性ARMD治疗药物临床研究正在开展[23-24]。

2模式识别受体

模式识别受体(PRR)是固有免疫系统中可识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern， PAMP)，如脂多糖、肤聚糖或病毒RNA，以及危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)，从而激活一系列免疫通路，引发免疫反应的受体[25-26]，主要包括Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)、核苷酸寡聚结合域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、视黄酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptor，RLR)、C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLR)和黑素瘤缺乏因子-2样受体(absent in melanoma-2-like receptor，ALR)等[27]。

NLR与干性ARMD的关系多通过炎症小体的激活来实现，除此之外目前被发现与干性ARMD发病相关的PRR主要是TLR。TLR是一类膜结合的PRR家族，通过对核因子κB(NF-κB)信号的激活和触发炎症反应细胞因子的释放介导免疫反应。TLR家族1～7、9、10在RPE上均有表达，其中TLR1和TLR3表达最高[28]。TLR3的激活具有细胞毒性，但Patel等[29]发现在氧化应激存在的情况下，TLR3的激活显著提高了RPE细胞的活性，保护其免受氧化应激诱导的死亡，这可能和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)水平上调，从而增强了细胞抗损伤性有关。Yang等[30]也发现，TLR3多态性rs3775291的412Phe变异体可以通过抑制RPE细胞的死亡来保护干性ARMD患者视网膜不进展至GA。此外，对TLR在ARMD中的作用主要集中于基因的研究。一项包含6项研究的Meta分析报告了TLR4与ARMD易感性的关联性，发现其多态性rs4986790(Asp299Gly)与ARMD易感性显著相关[31]。除此之外，TLR2、TLR3、TLR7等基因多态性也曾多次被报道与ARMD易感性相关[32-33]，但这种关联在印度及东亚等地区人种上却没有发现，说明可能存在地区或人种的差异[34-36]。

3炎症小体

炎症小体是一类在细胞内形成的多聚体蛋白质复合物，可介导对病原体感染和组织损伤的免疫反应，是固有免疫系统的重要组成部分[37-38]。经典炎症小体的结构由PRR等识别分子、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1的前体(pro-caspase-1)等三部分构成并根据其细胞内受体命名，主要包括NOD样受体家族(NLRs)、AIM2样受体家族(ALRs)、RIG-Ⅰ样受体家族(RLRs)及Pyrin蛋白等[39-40]。炎症小体在体内由PAMP或DAMP等激活后，ASC即启动对caspase-1的激活及对白细胞介素(IL)-1β、IL-18前体的剪切活化，释放至细胞外参与免疫反应过程[41-42]，这与阿尔兹海默症、糖尿病等与衰老相关的慢性炎性过程密切相关[43-45]。

自2002年炎症小体的概念被提出以来，NLRP3是目前为止研究最多、具有最广泛激活剂的炎症小体，可通过钾外流、溶酶体失稳及活性氧(ROS)的生成等多种机制激活[46]。2012年，Doyle等[47]发现ARMD患者的亚RPE玻璃膜疣沉积成分可以激活外周髓细胞和单核细胞中的NLRP3炎症小体和caspase-1，导致成熟IL-1β和IL-18的分泌，从而提出NLRP3参与ARMD的概念。近年来随着研究的逐渐深入，发现NLRP3炎症小体的活化可能是氧化应激、光损害等造成干性ARMD玻璃膜疣、视网膜变性等病理改变的关键机制[48]。

淀粉样β(Aβ)和脂褐素的主要成分N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)均可在玻璃膜疣中检出，它们通过激活NLRP3炎症小体诱导的慢性炎症被认为是早期ARMD的关键致病过程[49-51]，Tseng等[52]对具有GA的晚期干性ARMD患者眼组织进行切片染色，结果显示病变部位NLRP3着染，进一步检测发现患者RPE细胞中NLRP3、ASC和pro-caspase-1均高表达。Piippo等[53-54]研究发现，暴露于蛋白酶体抑制剂MG-132及巴弗洛霉素A1(BafA)的RPE细胞处于高度氧化应激状态，释放的ROS通过激活NLRP3炎症小体生成IL-1β，从而触发大量IL-8的产生，导致进一步病理性炎症的发生，而抗氧化剂的使用阻止了这一过程的发生。Wooff等[55]对干性ARMD模型小鼠研究发现，依赖于caspase-1的炎症小体在光氧化损伤引起的视网膜变性中参与了炎症的发生和细胞的死亡，而caspase-1的显著上调可能与光感受器细胞死亡水平的升高有关[56]。Kerur等[57]则认为GA的发生可能与环GMP-AMP合酶(cGAS)介导、caspase-4(在小鼠中为caspase-11)和caspase-1激活的非典型炎症小体途径有关。

4细胞因子

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白或多肽的总称，用于细胞间信号传导和相互作用。细胞因子家族包括IL、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子和生长因子等[58-59]。近年研究发现，ARMD的发生进展与细胞因子的生理功能关系密切[60]。

4.1白细胞介素IL-18、IL-17和IL-6等多种IL与干性ARMD患者RPE变性萎缩的关系密切。Ijima等[61]检测ARMD患者血清中IL-18的含量，发现干性ARMD患者血清IL-18比对照组(无新生血管或视网膜变性等眼底病变的其他眼病人群)高约48.9%，且在小鼠视网膜下注射IL-18可引起类似干性ARMD表现的视网膜变性。在体内，IL-18还可通过炎症小体的激活释放，Tarallo等[62]发现核糖核酸酶DICER1的缺乏诱导人RPE细胞死亡及变性从而导致GA的发生可能是通过NLRP3炎症小体的激活分泌IL-18，从而触发髓样分化因子88(MyD88)信号传导途径导致。Litwińska等[63]检测ARMD患者血清多种炎性因子的含量，发现在校正了年龄、性别等存在的差异后，干性ARMD患者体内IL-6及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度较高，而TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12均处于较低浓度。Cao等[64]研究了干性ARMD患者血浆细胞因子与CFH基因Y402H多态性的关系，发现CFH-Y402H多态性纯合子高危CC变异患者的IL-6水平显著高于其他基因型患者，IL-18水平高于CT变异患者，血液中较高浓度的细胞因子可能会使局部视网膜环境处于促炎状态，这也解释了为什么CFH基因CC变异患者比TT变异患者具有更高的ARMD进展风险。

IL-17家族中IL-17A与IL-17RC在ARMD患者眼中高表达，可能与ARMD的发展相关。Ardeljan等[65]检测了晚期ARMD患者眼组织的IL-17含量，发现与正常组织比，黄斑部IL-17A表达平均高14～20倍，IL-17RC高47～93倍，同时发现经沉默RNA转染、降低了IL-17RC表达能力后，IL-17A活性降低，并显著降低了caspase-9和caspase-3的激活，抑制了对RPE的细胞毒性。另有研究发现，IL-17RA的高表达及对下游促炎细胞因子的上调或许是RPE在氧化应激时发生变性或死亡的关键机制[66]。

4.2趋化因子及其受体多种趋化因子及其受体被证实与干性ARMD RPE萎缩及GA的发生有关。C-C型趋化因子受体3(CCR3)是CCL5、CCL7、CCL11、CCL24、CCL26的受体，Kuse等[67]通过动物实验发现其与光照导致的感光细胞死亡有关，对CCR3的抑制降低了ROS的水平和由光诱导的caspase-3、caspase-7的活化，减缓了小鼠感光细胞的死亡速率。CX3CR1是趋化因子亚家族CX3C唯一成员CX3CL1的特异性受体，近年来被证实与ARMD的发病关系密切[68]。Combadière等[69]发现ARMD患者眼底视网膜变性部位有大量小胶质细胞的聚集，且CX3CR1表达阳性，并且在玻璃膜疣中发现了CX3CR1沉积物，因此推断CX3CR1阳性小胶质细胞的积聚可能与玻璃膜疣形成、光感受器变性有关。而敲除了CX3CR1基因的小鼠视网膜下同样出现脂质膨胀的小胶质细胞沉积，被认为是干性ARMD玻璃膜疣现象的起源[70]。此外，CCL2、CCR2、CX3CR1等多种趋化因子或受体的基因多态性都表现了与干性ARMD的相关性[71-72]。

基于趋化因子与视网膜变性的密切联系，趋化因子基因敲除小鼠被广泛用于制作干性ARMD的实验模型。CCL2和CX3CR1基因缺陷的小鼠均被发现眼底出现了玻璃膜疣生成、光感受器萎缩及视网膜变性等干性ARMD的典型表现[73-74]。因此，Tuo等[75]制作了CCL2-/-/ CX3CR1-/-双基因敲除(DKO)小鼠，通过对眼底组织病理学及蛋白组学分析，发现DKO小鼠在6周龄时即表现出视网膜变性等干性ARMD症状，Ross等[76]进一步检测其眼免疫蛋白的水平，发现DKO小鼠与人类ARMD患者显示出相似的免疫病理学特征，支持CCL2-/-/ CX3CR1-/-作为人类干性ARMD的合适模型。

5小结

干性ARMD是一种由多因素造成的复杂眼病，病因及发病机制尚不完全明确，且目前尚无有效疗法。尽管其具体发病原因不明，但炎症及免疫反应在其发病机制及疾病进展过程中起到了推动作用，而炎症反应的完成很大程度依赖于免疫分子的活化与信号转导。因此，深入研究各免疫分子在干性ARMD发生发展过程中的具体功能及作用途径，有助于阐明干性ARMD的机制，为干性ARMD的治疗提供新的思路。