杜仲种质资源果实性状变异及综合评价

杜庆鑫，庆 军，刘攀峰，王 璐，杜兰英，何 凤，杜红岩

(国家林业和草原局泡桐研究开发中心，中国林业科学研究院经济林研究开发中心，经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，河南 郑州 450003)

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）为杜仲科（Eucommiaceae）杜仲属（Eucommia）植物[1]，雌雄异株，是我国特有的名贵药材和木本油料树种，广泛分布于我国亚热带到温带的28 个省（市、区）。杜仲果、叶、皮中均含有丰富的杜仲橡胶，其中，果皮中含量最高。杜仲橡胶有独特的“橡（塑）二重性”，可开发出具有热塑性、热弹性和橡胶弹性等不同用途的功能材料，广泛应用于航空航天、国防、电力、医疗、运动竞技等领域，是世界上具有巨大开发前景的优质天然橡胶资源[2-3]。杜仲果实不仅橡胶含量高，而且富含油脂。杜仲籽油不饱和脂肪酸含量达90%以上，其中，α-亚麻酸含量高达67.6%，杜仲籽油已被列为新食品原料目录，是开发保健品、功能食品、高档食用油的优质原料[4-5]。

植物种质资源是遗传改良的基因来源和物质基础，开展种质资源遗传多样性研究对资源保护和利用具有重要意义。表型性状变异具有相对稳定的遗传特征，已成为研究遗传多样性的重要内容，国内外已先后对大别山山核桃（Carya dabieshanensis

M.C.Liu et Z.J.Li））[6]、白 栎（Quercus fabriHance）[7]、柑 橘（Citrus reticulataBlanco）[8-9]、无患子（Sapindus mukorossiGaertn）[10-11]等林木表型性状变异进行了分析和评价。有关杜仲种质资源遗传变异和评价已开展了较多研究，杜红岩等[12]对16 个产地杜仲果实形态及含胶量差异进行了分析；杜庆鑫等[13]对杜仲种质资源雄花形态性状变异进行了深入研究；庆军等[14]发现，杜仲种质资源叶片活性成分表现出丰富的多样性，并筛选出叶用杜仲优良种质；于靖[15]分析评价了不同产地、不同基因型杜仲种仁脂肪酸及果皮杜仲胶含量差异。此外，分子标记技术也广泛应用于杜仲种质资源遗传多样性研究，Wu 等[16]、Yu 等[17]利用ISSR标记对杜仲种质资源遗传多样性和群体遗传结构进行了研究，发现杜仲居群内具有丰富的遗传多样性，而不同群体间的遗传多样性低。利用分子标记技术可以准确了解植物遗传多样性，但最终仍要结合表型性状进行分析[18]。目前，对大样本杜仲种质资源果实表型性状变异研究和综合评价鲜有报道。本研究对331 份不同来源杜仲种质资源果实表型性状进行多样性分析，以期揭示杜仲资源表型变异规律并进行综合评价，定向筛选优良种质，为选育适合杜仲产业化开发的优良品种提供理论和材料基础。

1 试验材料

试验材料均来自中国林业科学研究院经济林研究开发中心杜仲种质资源库。基因库采用6 株小区，定植株行距为 3 m×3 m。2018 年秋季果实成熟期完成采样，采后低温保存至实验室充分阴干。种质来源见表1。

表1 杜仲种质资源信息Table 1 Information of Eucommia ulmoides germplasm resources

2 研究方法

2.1 果实形态性状测定

四分法随机抽取果实20 粒，重复3 次。使用电子游标卡尺（精度0.01 mm）分别测量果实和种仁的纵径、横径、侧径，使用千分之一电子天平测定果实、种仁及包裹种仁果皮百粒质量，计算出仁率（出仁率=种仁百粒质量/果实百粒质量×100%）、果型指数（果型指数=果实纵径/果实横径）、果实体积指数（果实体积指数=果实纵径×果实横径×果实侧径）、种型指数（种型指数=种仁纵径/种仁横径）、种仁体积指数（种仁体积指数=种仁纵径×种仁横径×种仁侧径）等指标。

2.2 果皮杜仲橡胶含量测定

称量100 mg 干燥样品粉末至离心管中，加入1.5 mL 50%无水乙醇，涡旋振荡1 min，离心2 min，重复3 次；加入1.5 mL 丙酮，涡旋振荡1 min，离心2 min，重复3 次；加入1.5 mL 丙酮，超声分离（40 kHz，40℃）40 min，涡旋振荡1 min，离心2 min，重复2 次；50℃烘箱中烘干；加入1.2 mL 甲苯，涡旋振荡1 min，超声提取10 min，离心2 min，收上清液于容量瓶中，加甲苯定容至5 mL，重复提取4 次；采用FTIR 进行检测，计算1380 cm−1和699 cm−1处的峰面积。

2.3 种仁粗脂肪及脂肪酸含量测定

种仁粗脂肪采用索氏提取原理，质量法测定，参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》。种仁粗脂肪中亚麻酸、油酸、亚油酸检测采用《食品中脂肪酸的测定》（GB 5009.168—2016）。

2.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 整理统计数据，运用SPSS 24.0 软件进行数据分析。统计各性状的平均值、最大值、最小值和标准差，计算各性状变异系数（CV）和遗传多样性指数（H）。根据平均值（μ）和标准差（σ）将各性状划分为10 级，从第1 级Xi<（μ−2σ）到第10 级Xi≥（μ+2σ），每0.5σ为1 级，统计各级的分布频率。遗传多样性指数计算公式为：H=−∑pilnpi，其中，pi为某一性状第i级别试验材料份数占总份数的百分比。

聚类分析采用欧式平方距离ward 法。以累积贡献率 ≥ 85%、特征值 >1 为提取主成分的标准。综合评价方法为：以各主成分对应的相对贡献率作为权重，各主成分得分与相应权重进行线性加权求和得到综合评价函数[19]，主要公式如下：

式中：Z为杜仲果实综合评价得分，Zi为各主成分得分值，βi为各主成分对应的相对方差贡献率，i为主成分数。

3 结果与分析

3.1 果实性状变异及多样性分析

331 份杜仲种质资源果实性状变异情况见表2。19 个性状变异系数（CV）介于4.64%～25.79%，平均为12.65%，其中，变异系数较高的为包裹种仁果皮百粒质量（25.79%）、种仁百粒质量（22.32%）、种仁体积指数（22.02%）、果实体积指数（19.53%），变异系数较低的为亚麻酸（4.64%）、油酸（5.78%）、果实横径（7.92%）、纵径（8.15%）、果型指数（8.04%）。包裹种仁果皮百粒质量及种仁百粒质量变异较大表明与产量相关性状变异丰富，亚麻酸、油酸和果型指数变异系数较小表明遗传特性较稳定。

表2 杜仲果实主要性状统计分析Table 2 Statistical analysis of fruit traits of Eucommia ulmoides germplasms

19 个性状表现出丰富的遗传多样性，遗传多样性指数（H）介于1.6572～2.0947，平均值为2.0234，其中，杜仲橡胶（2.0947）、粗脂肪（2.0896）、种仁纵径（2.0765）、亚麻酸（2.0762）、果实横径（2.0749）、油酸（2.0707）等性状遗传多样性指数较大，表明这些性状在每一级中的分布比较均匀，出仁率（1.6572）、种仁横径（1.8426）、种仁体积指数（1.9531）遗传多样性指数较小，表明这几个性状在表现型上分布不均匀。

3.2 不同来源杜仲种质果实性状分析

不同来源杜仲果实19 个性状平均值、标准差和多重比较结果（表3）表明：除果实纵径、种仁横径、种仁体积指数外，其它性状在不同来源间均存在差异。福建杜仲资源果实纵径、横径、侧径、果实体积指数、果实百粒质量、种仁横径、种仁体积指数、包裹种仁果皮百粒质量最大，杜仲橡胶含量最高，但出仁率最低；陕西杜仲资源的果型指数、种仁纵径、种型指数最大，杜仲橡胶含量和油酸含量最低；吉林杜仲资源种仁百粒质量最大，出仁率最高；安徽杜仲资源果实百粒质量、种仁百粒质量最小；粗脂肪含量云南资源最低，吉林资源最高；亚麻酸含量安徽资源最高，四川资源最低，油酸含量四川资源最高，亚油酸含量湖北资源最高。

表3 不同来源地杜仲果实性状比较（均值 ± 标准差）Table 3 Comparison of fruit traits from different origin among Eucommia ulmoides germplasms (Mean ± SD)

续表 3

3.3 果实性状间相关性分析

对19 个果实性状进行相关性分析，表4 表明：19 个性状间存在不同程度的相关性，且多数性状间表现为显著或极显著相关。果实百粒质量与果实纵径（0.611）、横径（0.694）、侧径（0.423）、果实体积指数（0.750）、种仁体积指数（0.599）、种仁百粒质量（0.701）等性状呈极显著正相关，说明果实体积指数和种仁百粒质量对杜仲果实质量的贡献率最大。果型指数与种型指数呈极显著正相关（0.463），果实体积指数与种仁体积指数呈极显著正相关（0.591），说明果实与种仁大小表现出一致性。杜仲橡胶含量与包裹种仁果皮百粒质量（0.822）、果实侧径（0.154）均呈极显著正相关，推测与杜仲胶丝大量存在于果皮中包裹种仁部分有关，杜仲橡胶含量与种仁粗脂肪含量呈显著负相关（−0.116），推测杜仲橡胶与粗脂肪合成存在一定程度的竞争关系。此外，亚麻酸含量与油酸（−0.730）、亚油酸（−0.871）呈极显著负相关，推测亚麻酸与油酸、亚油酸合成过程中有一定程度的竞争关系。

表4 杜仲果实主要性状相关性分析Table 4 Correlation analysis of fruit traits of Eucommia ulmoides germplasms

3.4 基于果实性状的聚类分析

采用欧式平方距离ward 法对19 个性状进行聚类分析，在欧氏距离为5 时，331 份杜仲种质可分为3 个类群，所划分类群与地理来源关系较小，各类群性状特征见表5。第Ⅰ类群有97 份种质，其果实纵径和横径均最小，归为小果型类群，果实百粒质量平均仅7.05 g；第Ⅱ类群有182 份种质，其果实纵径和横径介于第Ⅰ类群和第Ⅲ类群之间，为中型果类群，果实百粒质量平均8.32 g；第Ⅲ类群有52 份种质，其果实纵径和横径最大，为大果型类群，果实百粒质量平均达9.59 g。各性状在3 个类群中均表现出不同程度的变异，第Ⅰ类群的变异系数为4.50%～26.62%，第Ⅱ类群的变异系数为4.87%～25.34%，第Ⅲ类群的变异系数为4.08～25.93%；亚麻酸含量在3 个类群中变异系数最小，包裹种仁果皮百粒质量和种仁百粒质量在3 个类群中变异系数较大。3 个类群间果型指数、种型指数、出仁率、杜仲橡胶含量、亚麻酸、油酸、亚油酸差异不显著，其它性状中，第Ⅲ类群果实纵径、横径、侧径、果实体积指数、果实百粒质量、种仁纵径、侧径、种仁体积指数、种仁百粒质量均极显著高于第Ⅰ和第Ⅱ类群，种仁横径、包裹种仁果皮质量、粗脂肪含量在第Ⅱ和第Ⅲ类群间差异不显著，但均极显著高于第Ⅰ类群。

表5 不同类群主要性状比较Table 5 Comparison of main traits among three groups

3.5 果用杜仲优良种质筛选

3.5.1 杜仲果实性状主成分分析 对19 个杜仲果实性状进行主成分分析，结果（表6）显示：前7 个主成分累积贡献率达85.169%，表明前7 个主成分代表了杜仲果实性状的大部分信息，因此，选取前7 个主成分对果用杜仲种质进行评价。第1 主成分贡献率最大，为24.334%，决定第1 主成分的为果实百粒质量（FrW）、果实体积指数（FVI）、果实纵径（FVD）、果实横径（FHD）及种仁纵径（SVD），说明第1 主成分主要与果实产量相关；第2 主成分贡献率为12.671%，决定第2 主成分的为亚麻酸（C18:3）、亚油酸（C18:2）及油酸（C18:1）含量，说明第2 主成分主要与亚麻酸油为主的脂肪酸含量相关；第3 主成分贡献率为10.917%，决定第3 主成分的为种仁横径（SHD）、种仁体积指数（SVI）及种型指数（SSI），说明第3 主成分主要与种仁大小和形态有关；第4 主成分贡献率为9.677%，果型指数（FSI）的特征向量值最高，主要与果实形态相关；第5 主成分贡献率为9.604%，特征向量值最大的为包裹种仁果皮百粒质量（FPW）和杜仲橡胶含量（EUR），表明第5 主成分重点表征了杜仲橡胶产出能力；第6 主成分贡献率为9.018%，出仁率（SKC）、种仁百粒质量（SKW）的特征向量值较大，表明第6 主成分重点表征种仁油脂产出能力；第7 主成分贡献率为8.949%，决定第7 主成分的为果实侧径（FLD）、种仁侧径（SLD）及粗脂肪含量（CF）。3.5.2 杜仲果实性状综合评价 经主成分分析提取了7 个主成分，计算331 份杜仲种质在各主成分的得分及综合得分，筛选出前10 名表现最优种质（表7）。第1 主成分排名前10 的种质编号为10129C、10269C、10588C、10531C、10221C、10599C、11065C、10596C、10159C、10095C，这些种质来自北京、河南和福建，果实产量性状较优；第2 主成分表征亚麻酸为主的脂肪酸性状，排名前10 的种质编号为11028C、10183C、10034C、10233C、10467C、10504C、10037C、10171C、10150C、10043C，这些种质来自四川、北京、广西、河南、湖南；第5 主成分排名前10 的种质为10513C、10229C、10166C、10209C、10504C、10049C、10508C、14001C、10526C、10029C，这些种质来自河南、北京、河北、江西，杜仲橡胶产出能力表现较好；第6 主成分排名前10 的种质为10055C、11044C、10246C、10129C、10124C、10143C、10588C、10508C、10133C、11049C，这些种质来自河北、吉林、北京、河南、山西，种仁油脂产出能力较高；综合评价前10 的种质编号为10129C、10508C、10588C、10580C、10043C、10531C、10035C、10152C、11065C、10596C，最优的种质来自北京万泉河路，其次是河南洛阳，河南洛阳有3 份种质入选。部分优异种质照片见图1。

图1 杜仲优异种质Fig.1 Excellent germplasms of Eucommia ulmoides

表6 19 个性状前7 个主成分的特征向量、特征值、贡献率及累积贡献率Table 6 Power vector(PV),eigenvalues(E),contribution rate(CR) and cumulative contribution rate(CCR)of first seven principal components(PC) based on 19 traits

表7 杜仲种质主成分得分和综合得分Table 7 Principal component scores and overall scores of Eucommia ulmoides germplasms

4 讨论

表型变异是遗传变异最直接的表现，是遗传和环境相互作用的结果。杜仲为第四纪冰川侵袭后仅留存于我国的孑遗树种，在长期进化过程中，产生了丰富的变异。选用果实进行表型性状遗传变异研究，可以在一定程度上反映不同来源种质的变异大小和遗传多样性水平[20]。周强等[5]研究发现，湘西地区杜仲翅果性状存在较大变异，果实形态性状变异系数为5.9%～22.6%，遗传变异较大；魏艳秀[21]通过对杜仲果实形态性状的测定，发现不同种质遗传多样性指数为2.04～2.09，表现出丰富的多样性。本研究通过对331 份杜仲种质资源果实19 个性状测定分析，发现杜仲种质资源果实性状表现出丰富的多样性，19 个性状遗传多样性指数平均值为2.0234，杜仲橡胶含量遗传多样性指数最大（2.0947），其次是粗脂肪（2.0896）；变异系数平均值为12.65%，以果实百粒质量、包裹种仁果皮百粒质量和种仁百粒质量为代表的经济性状表现出15.20%～25.79%的变异幅度，而亚麻酸、油酸、果型指数等性状的变异系数较小，可能是这些性状表现较稳定。杜仲果实丰富的表型变异为优良资源选育提供了可能。对不同来源杜仲果实性状分析发现，除果实纵径、种仁横径、种仁体积指数外，其它性状在不同来源间均存在差异。

通过对杜仲果实性状相关性分析发现，杜仲果实重要经济性状杜仲橡胶含量与包裹种仁果皮百粒质量、果实侧径呈极显著正相关，魏艳秀[21]也得到了类似的结论，表明果实侧径可以作为筛选优异种质的重要参考指标；而杜仲橡胶含量与种仁粗脂肪含量呈显著负相关，表明杜仲橡胶含量与油脂的积累存在一定程度的竞争关系，这与周强等[5]研究结果相异，可能由于材料来源及样本数不同。亚麻酸含量与亚油酸呈极显著负相关，因此，在评价杜仲籽油品质时，应综合考虑亚麻酸与亚油酸的总和。

聚类分析可将性状相似的种质聚为一类，更好地分析各种质特点，对优良种质筛选和资源利用有较好指导作用。本研究将331 份杜仲种质划分为3 个类群，3 个类群不同性状表现出明显差异，第Ⅲ类群果实最大，平均果实百粒质量达9.59 g，杜仲橡胶含量和亚麻酸含量分别为16.09%和59.51%，均为3 个类群中最高，具有筛选高产、高质量优良品种的潜力；同时，发现不同种质在地理分布上呈现混杂分布，表明我国杜仲种质资源分布无明显地理变异趋势，可能与杜仲较强的适应性和长期的引种栽培活动有关。

国内关于杜仲优良种质评价筛选工作开展较早，张博勇等[22]结合有效成分、生长量等指标筛选出了药用杜仲优良无性系；杜红岩等[23]、杜庆鑫等[24]、庆军等[14]先后筛选出橡胶用、雄花用、叶用杜仲优良无性系；周强等[5]针对湘西地区杜仲种质资源果实性状进行了评价，筛选了杜仲胶和油脂含量高的资源；于靖[15]对不同产地、不同基因型杜仲种仁脂肪酸及果皮杜仲胶含量进行了分析评价。但针对果用杜仲优良种质筛选存在样本量少、评价性状不全面等问题。本研究收集我国18 个省（市）共331 份杜仲种质资源，涵盖了我国杜仲种质资源大部分类型，包含种质资源信息十分丰富。本研究基于杜仲果实表型性状，采用主成分分析法，提取了7 个主成分，并对杜仲种质进行评价。针对油用、橡胶用和综合利用等不同用途分别筛选出10 份最优种质。经综合评价筛选的前10 份最优种质为10129C、10508C、10588C、10580C、10043C、10531C、10035C、10152C、11065C、10596C，且有7 份属于第Ⅲ类群大果型群体，与聚类分析结果相近，在今后育种及开发利用时可作为优选材料着重考虑。

5 结论

杜仲种质资源果实性状存在不同程度的变异和丰富的多样性，以包裹种仁果皮百粒质量和种仁百粒质量为代表的产量指标变异最大，为杜仲良种选育提供了充足的资源。亚麻酸、油酸、果型指数等性状变异系数较小，果实形态较稳定。杜仲橡胶含量与种仁粗脂肪含量呈显著负相关，表明对杜仲橡胶合成过程投入的增加要以减少对种仁油脂积累的投入为代价。聚类分析将杜仲种质划分为3 个类群，类群间不同性状差异明显，但不同种质无明显地理变异趋势。针对不同用途分别筛选出10 份最优种质，为我国杜仲良种选育及综合利用提供了优异的种质基础。