CSE1L在人喉鳞癌颈淋巴结转移中的作用研究

张继华，李 浩，张媛媛，苏 静，薛海涛

(河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科，河北 石家庄 050031)

喉鳞癌是耳鼻咽喉-头颈外科的常见恶性肿瘤，国际流行病学调查显示，喉癌占头颈肿瘤的30%～40%，占全身肿瘤的1%～2.5%，T3、T4期喉癌淋巴结转移发生率为40%～65%，同无淋巴结转移患者相比，有淋巴结转移喉癌患者5年生存率降低约50%[1]，颈部淋巴结转移是导致患癌患者生存率降低的主要因素。目前临床医师主要根据术前影像学检查资料来间接判断患者是否存在颈部淋巴结转移，进而决定是否行颈部淋巴结清扫术。但肿瘤早期转移并不能导致相应淋巴结增大等异常表现，因此术前影像学检查并不能为医生提供确切的结果。临床急需找到一种能准确而有效判断患者是否存在淋巴结转移的生物标志物，为临床颈部淋巴结清扫术的实施提供客观依据。最近研究证实，染色体分离样蛋白1(chromosome segregation like 1 protein，CSE1L)在妇科肿瘤、淋巴瘤、结直肠肿瘤、乳腺肿瘤及肺肿瘤中均呈现高表达。CSE1L被认为与癌症的进展和转移有关。但其在喉癌中的表达情况尚少见报道。本研究对76例人喉鳞癌患者肿瘤组织及32例肿瘤周围正常喉黏膜组织中CSE1L蛋白的表达进行了检测，旨在探讨CSE1L同人喉鳞癌颈部淋巴结转移的关系，以为临床颈部淋巴结转移的判断及颈部淋巴结清扫手术的实施提供更可靠的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集并整理2016年1月—2018年12月河北医科大学第一医院收治的76例住院喉鳞状细胞癌患者标本及病历资料(患者术前均未经放化疗)，其中诊断声门上型患者48例，声门型患者28例；32例癌旁正常喉黏膜组织取自距离肿瘤切缘不小于0.5 cm(病理检查确认无肿瘤细胞存在)。76例喉鳞癌组织样本具体情况如下，男性62例，女性14例；年龄32～76岁，平均58岁；淋巴结转移39例(其中6例T1N1M0，5例T1N2M0，8例T2N1M0，9例T2N2M0，7例T3N1M0，2例T3N2M0，2例T4N1M0，0例T4N2M0)，无淋巴结转移37例(其中12例T1N0M0，12例T2N0M0，7例T3N0M0，6例T4N0M0)。临床分期：17例Ⅰ期,23例Ⅱ期,30例Ⅲ期，6例Ⅳ期。肿瘤分化程度：38例高分化，13例中分化，25例低分化。所有研究样本均经病理科两位副高以上职称医生确认。

1.2主要试剂及仪器设备 CSE1L免疫组织化学用多克隆抗体，武汉博士德公司，工作浓度为1∶85。免疫组织化学用SP染色试剂盒、DAB显色用试剂，北京中杉金桥生物公司。倒置显微镜X-PC-2型倒置相差显微镜，日本OLYMPUS。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学切片 修剪留取组织标本，常规脱水、固定、石蜡包埋，蜡块进行连续切片，厚度5 μm，切片稍干后4 ℃冰箱低温保存备用。

1.3.2免疫组织化学指标检测及方法 ①复温：于冰箱内取出切片，使其温度上升至室温。②抗原修复：将切片置于0.01 mol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，以高温高压热修复抗原2 min。待其温度恢复至室温后，蒸馏水冲洗两次，PBS液浸洗5 min。③灭活内源性过氧化物酶：3%的双氧水孵育10 min，蒸馏水冲洗两次，PBS液浸洗5 min。④加一抗：滴加兔抗人CSE1L多克隆抗体一抗工作液(10 μL/份)，稀释度分别为1：85，37 ℃孵育1 h，用已知表达阳性切片做阳性对照，用0.1 mol/L PBS代替一抗作阴性对照。PBS冲洗5 min,共3次。⑤加二抗：滴加PV6001二抗，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS冲洗5 min,共3次。⑥DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间，自来水终止显色5 min。⑦苏木素复染细胞核(5 min)，再依次经过1%酸性酒精分化(30 s)、1%氨水返蓝(1 min)、70%酒精(10 min)、80%酒精(10 min)、90%酒精(10 min)、100%酒精Ⅰ(20 min)、100%酒精Ⅱ(20 min)、二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯漂洗Ⅱ(20 min)、中性树脂封片。

1.3.3结果判断 采用半定量双评分法，显微镜高倍镜视野下根据阳性细胞所占比例以及细胞染色强度做综合判定。表达强度评分标准：不着色，记0分，黄色，记1分，棕黄色，记2分，棕褐色，记3分。阳性细胞所占视野细胞比例评分标准：阳性细胞百分率<25%，记0分；阳性细胞百分率25%～50%，记1分；阳性细胞百分率51%～75%，记2分；阳性细胞百分率>75%，记3分。两种方法所得评分和，得分0～1为目的蛋白阴性(-)；得分2为目的蛋白弱阳性(+)；得分3～4为目的蛋白阳性(++)，得分5～6为目的蛋白强阳性(+++)。

1.3.4Western法测肿瘤细胞内CSE1L蛋白表达 参照试剂说明书，提取样本蛋白，制备Western blot检测样品，检测各组样品蛋白浓度，常规上样，配制选用12%分离胶以及4%浓缩胶，每组样品上样量65 μg，同时设置Marker预染蛋白，100 V电泳约1 h 25 min，转膜30 V，0.9 mA过夜。洗膜，定影后进行图象分析。

1.4统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1免疫组织化学检测CSE1L蛋白在人喉鳞状细胞癌及喉正常黏膜组织中的表达 39例有淋巴结转移患者中CSE1L蛋白阳性表达率为97%(38/39)；强阳性表达31例，中等强度表达6例，弱阳性表达1例，阴性1例。37例无淋巴结转移患者中CSE1L蛋白阳性表达率为38%(14/37)；强阳性表达2例，中等强度表达11例，弱阳性表达1例，阴性23例。32例瘤体周围正常喉黏膜组织标本中CSE1L蛋白均为阴性表达。见图1。

图1 CSE1在喉鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达情况(SP ×200)

2.2Western Blot检测CSE1L蛋白在人喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达 喉鳞癌伴淋巴结转移组CSE1L蛋白表达明显高于喉鳞癌无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P=0.041)；喉鳞癌无淋巴结转移组CSE1L蛋白表达明显高于癌旁正常黏膜组，差异有统计学意义(P=0.022)。见表1。

表1 CSE1L在喉鳞癌及癌旁正常喉黏膜中的表达情况

2.3CSE1L蛋白表达与喉鳞癌患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、原发部位、临床分期、病理类型及T分级喉癌组织中CSE1L的阳性表达率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CSE1L的表达与喉鳞癌患者临床病理学特征的关系

3 讨 论

喉鳞癌是耳鼻咽喉-头颈外科的常见恶性肿瘤，但由于喉癌的高淋巴结转移率，尤其是T3，T4期喉癌淋巴结转移发生率为40%～65%，使的这一部分患者5年生存率明显降低，同无淋巴结转移患者相比，有淋巴结转移喉癌患者5年生存率降低约50%[1]，复发和转移是导致喉癌病死率居高不下的主要原因，其中尤以声门上型及声门下型患者居多[2]。由于其发病部位隐匿，多数患者就诊于肿瘤晚期。

目前喉癌临床治疗仍以手术为主，单侧或双侧颈淋巴结清扫术是T3和T4期肿瘤标准治疗方案的一部分。但由于颈部是人体重要神经、血管的集中部位，相邻组织之间的关系密切，手术在彻底切除肿瘤的同时，也给患者带来诸如失声、吞咽困难、邻近重要神经、血管损伤等严重并发症，而同时行颈部淋巴结清扫术，无疑进一步加重了对患者的损伤，增加手术时间及住院时间，进一步降低了患者的生活质量。目前临床医师主要根据术前影像学评估颈部淋巴结转移情况及选择术式，但有一定局限性。使得目前颈淋巴结清扫术存在一定的盲目性，部分早期转移癌患者未行颈淋巴结清扫术，手术未能彻底切除肿瘤；部分未发生转移的患者却进行了颈淋巴结清扫术，加重了不必要的损伤。因而临床急需找到一种能准确而有效判断患者是否存在淋巴结转移的生物标志物，为临床颈部淋巴结清扫术的实施提供客观依据。

CSE1L负责调解importin-α从细胞核中的运输，在细胞质和细胞核中均有表达[3-4]。CSE1L可以与细胞微管和纺锤体相联系，通过刺激肿瘤细胞增殖来促进癌症进展。还通过增强肿瘤组织中的基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinase-2,MMP-2)分泌，通过调节P53基因的表达，增加肿瘤侵袭性[5-7]。 因此，在某些癌症类型中，CSE1L被认为与癌症的进展和转移有关[8-9]。最近研究证实，CSE1L在妇科肿瘤、淋巴瘤、结直肠肿瘤、乳腺肿瘤及肺肿瘤中均呈现高表达[10-14]。

在头颈肿瘤方面，有关CSE1L的研究较少，Wang等[15]研究表明，CSE1L同鼻咽癌患者预后无关。然而，Li等[16]报道，CSE1L在鼻咽癌细胞凋亡、侵袭及转移方面发挥作用。Wang等[13]报道，CSE1L在区分伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中起着重要的作用。因此，有必要对喉鳞癌患者临床特征同其淋巴结转移之间的关系进行研究。

本研究通过免疫组织化学和蛋白印记Western Blot法对人喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常黏膜组织中CSE1L蛋白的表达进行了检测，探讨了CSE1L同人喉鳞癌颈部淋巴结转移的关系。结果显示39例有淋巴结转移患者中CSE1L蛋白阳性表达率分别为97%(38/39)；强阳性表达31例，中等强度表达6例，弱阳性表达1例，阴性1例。37例无淋巴结转移患者中CSE1L蛋白阳性表达率分别为38%(14/37)；强阳性表达2例，中等强度表达11例，弱阳性表达1例，阴性23例。32例瘤体周围正常喉黏膜组织标本中CSE1L蛋白均为阴性表达。有淋巴结转移的患者中，喉鳞癌组织中CSE1L的阳性表达率高于无淋巴结转移的患者喉鳞癌组织，差异有统计学意义。不同性别、年龄、原发部位、临床分期、病理类型及T分级喉癌组织中CSE1L的阳性表达率比较差异均无统计学意义。

综上所述，CSE1L有可能成为判断人喉鳞癌颈部淋巴结转移生物学标志物。为临床颈部淋巴结转移的判断及颈部淋巴结清扫手术的实施提供更可靠的理论依据。