不同杀菌剂对陇南花椒根腐病病原菌的室内毒力测定

田凤鸣，陈 强，何九军，卓平清，王让军

(1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃 陇南 742500;2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 陇南 742500)

花椒产业已成为陇南市6个宜椒县(区)、80个乡(镇)、92 万农民的主要经济来源，重点突出的“一区五片”，即武都区、宕昌县沙湾片、文县临江片、康县平洛片、西和县大桥片、礼县下四区片花椒生产基地，基本实现了栽培区的全覆盖[1].花椒在生长发育过程中，由于环境不适或受病原菌的侵害，经常会出现一些影响花椒树的生长、挂果结实和产品质量的病害.常见病害有花椒菟丝子、花椒锈病、花椒根腐病、花椒落叶病、花椒炭疽病、花椒溃疡病、花椒枯梢病、花椒枯枝病、花椒叶斑病、花椒膏药病等[2].其中由腐皮镰刀菌(Fusariumsolani(Mart)Sacc.)[3]引起的花椒根腐病导致根系腐烂，地上部分叶片变小枝条发育不全，最终导致整株枯死，严重影响花椒产量和品质，给花椒产业造成重大的经济损失.花椒根腐病的防治一直是生产上难以解决的问题.由于花椒病虫害多发，农药和化肥的使用量大，且有关部门对花椒生产、加工、流通的监管力度不够，致使花椒生产存在较大的生态和食品安全隐患.目前防治花椒根腐病的药物主要有周玲燕[4]提出的甲基布托津、多菌灵、粉锈宁药物，韩生录等[5]提出的甲基硫菌灵药物，其药物单一，长期使用，田间效果会降低.

本实验选用14种低毒的农药为杀菌剂，以本实验室分离出的花椒根腐病病原菌茄腐镰孢菌H1为目标菌， 采用菌丝生长法对茄腐镰孢菌进行室内毒力测定，以期筛选出高效、污染小、低毒的农药药品，为后期田间有效防治花椒根腐病提供可靠的理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

病原菌由本实验室从陇南武都区花椒种植基地采样，从典型的花椒根腐病病株中分离获得，经致病性实验及分子鉴定确定茄腐镰孢菌(Fusariumsolani)是造成陇南花椒根腐病的主要病原菌，命名为H1，该病原菌保存于4℃冰箱，药物试验时在PDA培养基中活化备用.

1.2 供试药剂

14种杀菌剂的详细情况见表1.

1.3 方法

1.3.1 PDA培养基的制备

马铃薯200 g(去皮，切小块，沸水中20 min～30 min，四层纱布过滤，滤液备用)，琼脂粉15 g～20 g，葡萄糖20 g加入马铃薯滤液中，少量水溶解后定容至1000 mL，高压灭菌后倒平板.

1.3.2 菌饼的制备

将4℃保存的病原菌接种于PDA培养基中，于25℃恒温培养箱中培养3 d～5 d，用无菌琼脂打孔器打成6 mm的菌饼备用.

1.3.3 含药培养基的制备

对供试农药，根据药剂活性，每种农药设置5个不同的系列质量浓度，将配好的PDA培养基灭菌后，待温度到50 ℃～60 ℃时，用移液枪取9 mL的PDA培养基和1 mL配制好的农药加入无菌离心管中，摇匀后倒入无菌培养皿中，每种梯度的农药重复3次，对照组中加9 mL的PDA培养基和1mL的无菌水倒入平板备用.

1.3.4 室内毒力测定试验-菌丝生长速率法

在无菌操作条件下，将培养好的菌饼利用接种器接种于含药平板中央，菌丝面朝下，盖上培养皿盖子，封上封口膜，置于25℃恒温培养箱中，72 h后根据空白对照培养皿中的菌丝的生长情况，利用十字交叉法测定菌落直径，取其平均值，菌落直径用mm统计.

1.3.5 数据分析

将统计好的菌落直径的数据用以下公式计算每种梯度的农药抑制率，并将其换算成对应概率值作为纵坐标y， 以浓度对数为横坐标x， 使用 DPS 7.05 软件计算每种农药的毒力回归方程y= ax+b，并分析EC50值和最终不同杀菌剂对花椒根腐病病原菌的相对抑制效果．

菌落增长直径D(mm)=测量菌落平均值-6.

(1)

菌丝生长抑制率(%)=(处理菌落增长直径(D1)/对照菌落增长直径(D2)×100%.

(2)

2 结果与分析

本试验选取14种杀菌剂分析不同杀菌剂对花椒根腐病主要病原菌茄腐镰孢菌H1菌丝的抑制作用.该14种杀菌剂均为低毒性杀菌剂，其中选取了三种来自不同厂家的枯草芽孢杆菌来分别测定对花椒根腐病病原菌茄腐镰孢菌的室内毒力抑制效果(见表2).

表1 供药试剂及生产厂家

表2 14种不同杀菌剂的处理浓度及抑制率

杀菌剂质量浓度(mg/L)抑制率(%)杀菌剂质量浓度(mg/L)抑制率(%)代森锰锌600052.8400047.5200041.6100035.750030.3氟硅唑458.4249.4140.40.531.90.2524.3甲基硫菌灵10082.95042.22520.712.59.26.250.8多菌灵455.7247.1138.40.530.40.2523.3枯草芽孢杆菌(300亿/克)472.9269.3162.40.556.50.2547.2枯草芽孢杆菌(10亿芽孢/克)600061.1400055.8200046.4100037.250028.4枯草芽孢杆菌(1000亿/克)10062.15056.62551.112.545.66.2540.2氯溴异氰尿酸100005000100010010

表3 不同杀菌剂对花椒根腐病病原菌室内毒力测定结果

由表1、表2表明，选取的14种杀菌剂除氯溴异氰尿酸杀菌剂对该菌无抑制活性外，其余13种均有不同程度的抑制活性，并且此13种杀菌剂的回归方程相关系数均大于0.90，与1较接近，说明两变量线性关系密切，试验可信度高.按照不同药剂的活性，在5种不同质量浓度处理下，随质量浓度的增加抑制率也随之增大(见表2)，其中300亿/克的枯草芽孢杆菌、氟硅唑、四霉素、多菌灵、咯菌腈5种杀菌剂在处理浓度为4 mg/L时，抑制率分别达到72.9%、58.4%、61.8%、55.7%、59.9%，对茄腐镰孢菌均表现出较强的抑制效果，EC50值分别为0.41 mg/L、2.08 mg/L、2.39 mg/L、2.57 mg/L、3.02 mg/L，其中对该菌毒力最强的杀菌剂为300亿/克的枯草芽孢杆菌，此结果与室内5种较强杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响结果相一致，随杀菌剂浓度的增加，病原菌菌丝的生长也逐渐减慢，300亿/克的枯草芽孢杆菌在4 mg/L时病原菌菌丝生长最慢(见图1)；其次1 000亿个/克的枯草芽孢杆菌、甲基硫菌灵、寡雄腐霉菌对该菌也表现出了相对较强的毒力活性，其处理浓度为100 mg/L时，抑制率分别达到62.1%、82.9%、51.3%，其EC50值分别21.37 mg/L、54.95 mg/L、89.13 mg/L；噁霉灵、笨醚甲环唑、根腐灵对该菌的毒力相对较弱，其处理浓度分别500 mg/L时、抑制率分别达到61.8%、52.6%、59.5%，其EC50值分别223.87 mg/L、254.47 mg/L、346.76 mg/L；10亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌、代森锰锌对该菌的毒力表现出明显较弱的毒力活性，其处理浓度分别6 000 mg/L时，抑制率分别61.1%、52.8%，其EC50值分别为2 570 mg/L和5 248.07 mg/L；氯溴异氰尿酸在5种处理浓度下对该菌的毒力强度为0，对菌丝无抑制效果.因此通过室内毒力测定结果显示，14种杀菌剂对腐皮镰孢菌的抑制效果排名为300亿/克的枯草芽孢杆菌>氟硅唑>四霉素>多菌灵>咯菌腈>1 000亿个/克的枯草芽孢杆菌>甲基硫菌灵>寡雄腐霉菌>噁霉灵>笨醚甲环唑>根腐灵>10亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌>代森锰锌>氯溴异氰尿酸.

图1 5种较强杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响

CK为对照菌丝生长结果.A1-A5分别为300亿/克的枯草芽孢杆菌的不同处理浓度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L.B1-B5分别为氟硅唑的不同处理浓度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；C1-C5分别为四霉素的不同处理浓度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；D1-D5分别为多菌灵的不同处理浓度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L；E1-E5分别为咯菌腈的不同处理浓度4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L.

3 结论

长期以来，化学农药在植物病害的防治中起主要的作用[6].根据国内外相关报道，长期单一不合理的使用不仅给植物生产中的食品带来农药残留而且病原菌对药物容易产生抗性等问题[7-9]，为减少花椒生产中存在的生态和食品安全隐患，筛选出高效、低残留、低毒的替代杀菌剂[10]是花椒生产中和根腐病病害防治中急需解决的问题之一.

本试验从14种杀菌剂中筛选出5种对茄腐镰孢菌抑制较强的杀菌剂，分别为300亿/克的枯草芽孢杆菌、氟硅唑、四霉素、多菌灵、咯菌腈，在处理浓度仅为4 mg/L时就能表现出很强的抑制效果，此5种杀菌剂可作为防治花椒根腐病的主要推广药物.在田间防治中可进行交替使用，减缓病原菌对单一药物的抗性.但是从5种杀菌剂的类型来看，300亿/克的枯草芽孢杆菌作为生物杀菌剂，其抑制效果强于其他4种化学杀菌剂，在处理浓度为4mg/L时，抑制率可达72.9%，EC50值为0.41 mg/L，在低处理浓度为0.25 mg/L时，抑制率依然可达47.2%.特别是枯草杆菌有着很快的繁殖速度，且有广泛的抗菌性和较强的抗逆性，是多种植物病原菌的拮抗菌，因此生物杀菌剂的开发和利用越来越受到科学家的青睐.以上结果与滕朕等人研究的生物农药对人参立枯病菌的室内毒力测定结果相同[11].

室内毒力测定结果显示在相同处理浓度下，枯草芽孢杆菌的抑制效果强于同等浓度处理的其他化学杀菌剂.其处理浓度为100 mg/L时，1000亿个/克的枯草芽孢杆菌抑制效果强于甲基硫菌灵，处理浓度为6000 mg/L时，10亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌抑制效果强于代森锰锌，这与枯草芽孢杆菌杀菌剂的杀菌效果优于某些化学农药的研究结果是一致的[12-14].购买于三种公司的枯草芽孢杆菌在不同的处理浓度下其表现出的抑制活性是不相同的，300亿/克的枯草芽孢杆菌(山东京青农业科技有限公司)>1000亿个/克的枯草芽孢杆菌(中国农科院植保所廊坊农药中试厂)>10亿芽孢/克的枯草芽孢杆菌(撒尔夫,河南农化有限公司).另外，本试验结果仅测定了单一杀菌剂对花椒根腐病主要病原菌茄腐镰孢菌的室内毒力作用，在后续的研究工作中，还需将此结果与田间药效试验相结合，并同时开展新的杀菌剂复配来防治花椒根腐病的相关试验， 新药剂的开发对于生产具有十分重要的意义[15].在高毒农药的禁用下，最经济有效的防治措施就是选育抗病品种[16]，这为花椒根腐病病害的抗病资源的鉴定和筛选工作具有重要意义.