脱落酸和赤霉素对核桃JrGSTU8基因响应炭疽病的表达调控

马凯恒，谢牧洪，郑欣悦，贾彩霞，洪心悦，孙宇栋，杨桂燕

（西北农林科技大学 a.林学院；b.陕西省核桃工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100）

植物为适应外界不利环境条件影响，进化出体内平衡机制进行应对。核桃Juglans regia在我国栽培历史悠久，分布广泛，种质资源丰富，是精准脱贫、乡村振兴和生态建设的重要树种[1]。随着核桃加工技术在医药、化工、工艺美术等多领域产业链的形成，优良品种选育、抗病分子机制研究相对薄弱，已成为核桃单产提高及产量稳定、核桃产业健康发展的不利因素[2]。近年来，病虫害的大面积爆发导致许多产区的核桃产量逐年下降，严重影响了地方综合经济效益[3-4]。我国核桃病害近30 种，危害涉及根、茎、叶、果实、嫩梢等各部位，其中以核桃炭疽病尤为突出，轻则影响产量和品质，重则可致绝收、树死[5]。但由于病害侵染核桃的机制不明，每年病害发生的具体时间把握不准，不能有效地制定防治措施。因此，加强核桃抗病机制研究，增强核桃树病害科学防治，是提高核桃产量和品质的基本前提。

植株受到病原危害时，其免疫系统会立即做出反应。植物免疫系统受各类激素信号分子调节，其中脱落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellin，GA）在病害防御响应中的作用受到越来越多的关注。Javier 等[6]证实ABA 在植物免疫中的作用通过PYR1 受体介导。AcTPR2在猕猴桃Actinidia chinensis中对灰葡萄孢Botrytis cinerea的反应与GA 相关[7]。病害响应极可能引发植株的抗逆防卫反应，其中抗氧化酶活性变化是最常见和最基本的体现。如，棉花Gossypium hirsutum胚芽样蛋白（Germin-like protein，GLP）GhABP19在调节植物对黄萎病Cyanosis和枯萎病Blight的抗性中对超氧化物歧化酶（SOD）活性的激发具有重要意义[8]。在橡胶树Hevea brasiliensis对棕榈疫霉菌Phytophthora palmivora诱导抗性中，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性明显增加[9]。用有益微生物（细菌和真菌）处理过的植物中可观察到谷胱甘肽转移酶GST基因的诱导或GST活性的升高，这些微生物可诱导对后续病原体感染的系统抗性反应（ISR）[10]。在这些抗氧化酶保护酶中，GST家族基因成员众多，功能多样，成为林木、农作物等抗逆育种的重要候选基因鉴定对象。

GST是具有解毒、清除细胞内活性氧（ROS）等功能的二聚体酶家族，在植物基因组中包含Phi、Tau、Theta 和Zeta 等4 大亚类[11]，其中Tau类GST在植物生物与非生物逆境响应中具有重要作用。如，羽衣甘蓝Brassica oleraceaBoGSTU19和BoGSTU24能响应低温胁迫被上调表达，推测其与抗寒相关[12]。核桃JrGSTTau1基因的超量表达能有效提高植株应对干旱和冷害胁迫[1,13]。大豆Glycine maxGmGSTU2-2对渗透胁迫具有高度特异性，认为GmGSTU2-2涉及植物胁迫的广泛催化和调节功能网络[14]。可见，Tau 类GST 是植株应对非生物胁迫的重要蛋白，对其进行鉴定，有助于揭示植株的抗性响应机制。目前，虽已从不少植株中克隆获得了一些GST成员，但Tau 类的发掘相对不足，尤其是木本植物Tau 类GST的报道较少。在GST功能解析上，以干旱、低温、盐、重金属[1,13,15-16]为主，对GST参与生物胁迫的报道较少，核桃GST 挖掘更是不够。因此，本研究在前期对核桃GST家族成员挖掘的基础上，对其中一条Tau 类GST（JrGSTU8）的基本生物信息及核桃炭疽病响应功能进行解析，以期为核桃抗病调控及管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

植物材料：2年生‘香玲’核桃嫁接苗。

病原材料：胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides（简写TJ），作者所在团队前期鉴定保存。

处理：分别制备浓度为1×106个·L-1的胶孢炭疽菌分生孢子液，配置100 μmol·L-1ABA 及GA 溶液。对植株分别进行TJ、ABA、GA、TJ+ABA、TJ+GA喷洒处理。以喷水处理为对照。在处理第0（对照）、1、6、9、12 天分别取叶和茎，用液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。每个处理包含6 棵植株。

1.2 JrGSTU8 基因鉴定与分析

用“glutathione transferase”在‘香玲’核桃转录组中筛选GST基因，经Blast 同源比对选取其中的1 条Tau 类GST（命名为JrGSTU8）进行分析。JrGSTU8基因的开放读码框（ORF）用ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定。根据确定的ORF 设计扩增引物JrGSTU8-F（5′-ATGGCTCTAAAACTGAAAGG-3′）和JrGSTU8-R（5′-CTATTTGGAGGCATCGGTAC-3′）。经PCR 及测序确定后的JrGSTU8序列基本特征通过Expasy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）确认。使用CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对JrGSTU8的保守结构域进行分析。利用BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）对同源蛋白进行搜索；利用MEGA7 构建系统进化树。使用NEW PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析启动子顺式作用元件。利用Swiss Model（https://swissmodel.expasy.org/）推测其蛋白三维结构。

1.3 JrGSTU8 基因响应病害的表达分析

采用CTAB 方法提取各样品总RNA[1]。RNA 经DNA 消化酶后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit（CWBIO，康为世纪，中国）反转录为cDNA，并经10 倍稀释后用作实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的模板。使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）制备qRTPCR 反应体系，在Applied Biosystems 生产的StepOneTMReal-Time PCR System 进行qRTPCR 反应。反应程序为：94℃/30 s；94℃/12 s，60℃/45 s，72℃/45 s，45 个循环；81℃/1 s，每个样品重复3 次。JrGSTU8定量引物为DL-F（5′-TACATCGATGAGACCTGG-3′）和DL-R（5′-AATCCAATCGCCTCTCCT-3′）。内参基因为核桃18S rRNA（HE574850），引物为18S-F（5′-GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT-3′）和18S-R（5′-TCGCATTTCGCTACGTTCTT-3′）[13]。定量结果用2-△△Ct法[17]分析，表示为相对于内参基因相对于对照（清水处理）的相对表达值。数据使用SPSS 软件包（SPSS，Chicago，Illinois，USA）分析。样品变异性用标准偏差表示。不同时间点与0 d 之间的表达差异用T 检验分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 JrGSTU8 基因基本生物信息

JrGSTU8基因ORF 长612 bp，推导蛋白的分子量为23 145.57 Da，含有203 个氨基酸，理论等电点为6.61，具有GST-Tau 保守域（图1），表明该蛋白属于Tau 类GST，因此命名为JrGSTU8。BLAST 发现该基因与核桃基因组中的GSTU8基因（GeneBank 登录号：XP_018849017.1）相同。经同源搜索并进行进化分析，发现JrGSTU8与杨梅Morella rubra的同源蛋白MrGSTU8进化关系较近（图2）。Swiss Model 同源建模预测的蛋白三维结构如图3所示。

图1 JrGSTU8 蛋白保守结构域Fig.1 The conserved domain of JrGSTU8 protein

图2 JrGSTU8 与其他物种相似蛋白的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of JrGSTU8 and its homologs from other species

图3 JrGSTU8 蛋白三维结构Fig.3 3D structure of JrGSTU8 protein

2.2 JrGSTU8 基因启动子特性

在NCBI 数据库中查找核桃基因组数据，鉴定获得其上游1 443 bp 的DNA 序列作为启动子并进行顺式作用元件分析，NEW PLACE 预测显示，该启动子正、反向共包含307个顺式作用元件位点，属于80 类不同元件，其中正向54 类，包括启动子常有元件TATABOX，种子、根、花粉等特异组织表达相关的元件，有GA、ABA、乙烯、植物生长素等植物激素相关的元件，也有热胁迫相关的CCAATBOX1、低温相关的LTRE1HVBLT49、干旱相关的MYCATERD1、铜胁迫相关的CURECORECR 等非生物胁迫响应元件，以及病害响应相关的BIHD1OS、WBOXATNPR1、WRKY71OS、RAV1BAT 等元件（表1）。

表1 NEW PLACE 预测的JrGSTU8 启动子正向包含的顺式作用元件Table 1 Cis-acting regulatory elements in JrGSTU8 promoter predicted by NEW PLACE in forward strand

续表1Continuation of table 1

2.3 JrGSTU8 基因响应ABA 和GA 的表达

对试材分别进行ABA、GA 处理。qRT-PCR分析发现JrGSTU8能被ABA、GA 显著诱导，且体现了叶、茎表达差异性。ABA 处理下，JrGSTU8在叶和茎中的表达随胁迫时间变化表现出相似趋势，在1～12 d 时的表达水平均显著高于0 d，9 d 达到最大值，分别为0 d 的4.89、3.69倍（图4A）。GA 处理下，JrGSTU8在叶和茎中的转录模式相似，在9 d 达到最大值，分别为0 d的5.51、4.30 倍（图4B）。且ABA 和GA 处理下，JrGSTU8在叶和茎中的表达变化相似（图4）。可见，JrGSTU8基因可被ABA 和GA 诱导，在功能行使中可能涉及ABA 和GA 信号通路。

图4 JrGSTU8 基因在ABA（A）和GA（B）处理下的表达水平Fig.4 The expression level of JrGSTU8 gene under ABA (A) and GA (B) treatments

2.4 JrGSTU8 基因响应核桃炭疽病的表达

胶孢炭疽菌处理后JrGSTU8基因的转录水平被显著提高，且体现了组织表达特异性（图5）。在叶中，JrGSTU8基因在0～1 d 之间的表达变化不明显，之后急剧上升，到9 d 达最大值，之后缓慢下降，1～12 d 的表达值分别为0 d 的1.18、3.19、4.32、4.09 倍。在茎中，与叶中不同的是在6、9 d 的表达相近，之后下降较快，1～12 d的表达值分别为0 d 的1.07、5.09、5.17、4.16 倍。可见，JrGSTU8基因能被核桃炭疽病正向诱导表达。

图5 JrGSTU8 基因在胶孢炭疽菌胁迫下的表达水平Fig.5 The expression level of JrGSTU8 gene under C.gloeosporioides stress

2.5 ABA 和GA 对JrGSTU8 基因响应炭疽病的影响

为了探明ABA 和GA 对JrGSTU8基因响应炭疽病是否有调控作用，对核桃分别进行TJ+ABA、TJ+GA 处理，并与单一TJ、ABA、GA 处理进行表达水平分析，发现JrGSTU8基因响应炭疽病的表达水平能被ABA 和GA 明显提高（图6），且表达趋势变化与对应单一的ABA 和GA 处理更为相似（图4）。在TJ+ABA 胁迫下，1～12 d 叶中JrGSTU8基因的表达水平分别是炭疽菌单独处理下的1.08、1.11、1.30、2.19、1.60 倍；茎中JrGSTU8基因的表达值在1～12 d 分别为单独炭疽菌胁迫下的1.91、2.35、1.50、1.91、1.60 倍（图5、图6A）。在TJ+GA 处理下，在叶和茎中的表达差距分别在1.08～1.77、1.30～2.89 倍（图5、图6B）。可见，ABA 和GA 对JrGSTU8基因响应核桃炭疽病具有一定调节作用。

图6 JrGSTU8 基因在胶孢炭疽菌与ABA（A）及GA（B）共同处理下的表达水平Fig.6 The expression level of JrGSTU8 gene under TJ+ABA (A) and TJ+GA (B)

3 讨 论

核桃作为我国广大山区脱贫致富、乡村振兴的重要特色经济木本油料树种，在提高种植户经济收入、推动区域经济发展上具有重要作用。核桃经济效益与核桃产量和品质直接相关，但由于近年核桃病害发生严重，核桃产量和品质得不到保障，严重影响了核桃经济效益。为了保证核桃产业的稳产、高产、高质，必须对核桃应对不同气候条件、病虫等制约因子具有准确把握与科学应对措施，尤其每年核桃病害发生的变化大，可控性相对差，需对其更加关注。这就要求选育核桃抗病优良品种，掌握核桃主要病害发生规律及防御机制。GSTs 具有多重生物学功能，在植物多重逆境响应中具有重要作用，其中，Tau 类GST 的功能更为丰富。如毛果杨Populus trichocarpaGSTU16和GSTU45的表达能被三硝基甲苯（2,4,6-trinitrotoluene）诱导，可能与有毒环境污染物的代谢有关[18]。水稻Oryza sativa OsGSTU30的表达能被干旱提高，OsGSTU30过表达株系对干旱耐受性强于野生型[19]。缺乏功能性GSTU13导致植株几种真菌病原体的易感性增强，包括白粉菌Erysiphe pisi、胶孢炭疽病菌等[20]。因此，本研究我们克隆获得一条Tau 类GST基因，JrGTSU8，进行抗炭疽病响应潜力分析。

首先，由于启动子起转录调节功能，可预测对应基因的功能。如，核桃JrDof3基因启动子中含有干旱等胁迫响应元件，推测JrDof3可能与植物干旱等逆境响应过程相关[21]。海蓬子Salicornia brachiataSbGSTU基因启动子包含病害、损伤、激素响应及MYB、MYC 等转录因子识别元件，调控该基因应对渗透胁迫[22]。玉米Zea maysZmCIPK10基因启动子包含ABA、GA、SA 等元件，参与调控ZmCIPK10响应NaCl、干旱等[23]。为了对JrGTSU8基因的功能进行快速有效的预测，分析了JrGTSU8基因启动子及其包含的顺式作用元件，发现JrGSTU8基因上游启动子中有80类不同元件，包含与逆境胁迫响应相关的如CCAATBOX1、LTRE1HVBLT49、MYCATERD1 等各类元件，其中病害响应及GA、ABA 信号通路相关元件较多，如BIHD1OS、WBOXATNPR1、WRKY71OS、RAV1BAT、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A、PYRIMIDINEBOXHVEPB1、CAREOSREP1（表2）。由于抗病响应通常涉及GA 和ABA 信号通路，如，PYR1的表达受ABA 调节，进而调节抗病性[6]；水稻NAC 转录因子ONAC066可通过抑制ABA 信号正向调节植株的抗病性[24]；新型大豆异源基因GmDIR22的表达可被GA 诱导且有助于促进木质素的生物合成并增强对大豆疫霉菌的抗性[25]。在病毒侵染野生大豆之前喷施GA 可以促进植株的生长，诱导植株抗病反应，降低病毒危害[26]。由此可推测，JrGSTU8基因很可能参与植物抗病响应过程。

为探明JrGSTU8基因是否参与病害响应，对核桃进行ABA、GA、胶孢炭疽菌、胶孢炭疽菌+ABA、胶孢炭疽菌+GA 等处理，分析不同感染时间叶和茎的表达模式。结果显示，JrGSTU8基因可被ABA、GA 及炭疽病诱导表达，且体现了组织表达差异（图4～5）。更为重要的是，JrGSTU8基因在同时进行炭疽病和ABA（TJ+ABA）、炭疽病与GA（TJ+GA）处理时，其表达水平明显高于单独炭疽病胁迫下的表达水平（图4～6）。可见，ABA 和GA 存在情况下，JrGSTU8基因转录活性被更加显著地诱导。这与其他基因响应病害表达的情况一致。如，小麦Triticum aestivum糖转运蛋白TaSTP6 受ABA 诱导表达增强促进条状锈菌Puccinia striiformis糖吸收而增强植株易感性[27]。大豆GmKR3的过表达增强大豆病毒抗性部分通过ABA 信号实现[28]。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）受GA 介导参与水稻巴卡奈病Fusarium fujikuroi的响应[29]。棉花GhMPK11在本氏烟草植物中的过表达可以通过GA 信号通路增强烟草对青枯病菌Ralstonia solanacearum和立枯丝核菌Rhizoctonia solani的易感性[30]。大豆GmDIR22基因的表达水平被外源GA 的增强而明显提高，并提高了抵抗大豆疫霉菌的能力[26]。本研究JrGSTU8基因响应炭疽病的表达活性被ABA和GA 显著增强，表明ABA 和GA 对JrGSTU8基因的抗病响应极可能具有积极调节作用。但本研究未在植株中表达进行功能验证，ABA 和GA 对JrGSTU8基因的具体调节机制仍需进一步确定。在后续研究中，将构建JrGSTU8基因植物过表达及抑制表达载体，分别转入木本和草本植株中获得JrGSTU8过量表达和抑制表达转基因株系，全面解析JrGSTU8的抗炭疽病功能。