“亚洲型”DEL血型检测方法的比较研究

杨 帆,韩 瑜,聂婷婷,刘玲玲,于江虹,焦立新,陈 琳

(吉林省血液中心，吉林 长春130033)

Rh血型系统中，D抗原免疫原性最强，大多数的Rh阴性个体，通过输血或妊娠，可受D抗原阳性红细胞免疫而产生抗D。Rh血型D抗原(RhD)阴性女性怀孕时胎儿会面临新生儿溶血病风险，所以常进行抗体筛查检测和抗D免疫球蛋白注射。但最新研究表明：中国RhD初筛阴性人群中，约17%-30%为“亚洲型”DEL血型，其分子遗传背景为RHD*1227A基因型，该血型红细胞表面表达完整的RhD抗原，怀孕妇女在RhD阳性胎儿的免疫刺激下不产生抗D，因此不需进行过于频密的抗体筛查检测和抗D免疫球蛋白注射。可是DEL血型检测并未常规应用于临床，造成该血型孕妇长期被作为RhD阴性对待。本研究通过对传统血型血清法(吸收放散法)与分子生物学法(荧光PCR法、PCR-SSP法和熔解曲线分析法)对“亚洲型”DEL血型检测，对RHD*1227A基因型检出率进行比较及一致性分析，为实验室及临床提供合理选择“亚洲型”血型检测方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源本血液中心357例经鉴定为RhD阴性的献血者血液标本，经过对DEL血型高度关联的C抗原[1]筛选，90例阳性标本用于检测“亚洲型”DEL血型。

1.2 仪器与试剂快速自动编程PCR仪(BIO-RAD)、荧光定量PCR 仪(ABI 7500，美国)、单克隆抗体IgG抗-D(上海血液生物医药有限责任公司)、单克隆抗体IgG+IgM(加拿大，IMMUCOR)、IgG+IgM(英国，MILLIPORE)；微柱凝胶抗人球卡(珠海贝索生物技术有限公司)、样本释放剂试剂盒(广州展全生物科技有限公司)、DNA提取试剂盒(康为世纪)、红细胞RHD基因分型检测试剂盒(江苏伟禾生物科技有限公司)。

1.3 检测方法

1.3.1血型血清学试验 待确认红细胞洗涤3遍后配制成浓度为0.8%-1%的红细胞悬液加入微柱凝胶抗人球卡3孔，分别加入3种抗-D试剂(单克隆IgG及IgM+IgG)，37℃孵育15 min后离心。对应血浆加入抗筛细胞，采用凝胶卡法进行抗体筛查。确认RhD阴性的红细胞1滴加入试剂抗-C，结果为阳性的样本进行下一步“亚洲型”DEL血型检测。

1.3.2DNA提取 严格按照DNA提取试剂盒说明书步骤操作，浓度介于15-40 ng/μl，A260/A280介于1.6-2.0之间。

1.3.3吸收放散法 参照文献报道[2]及试剂盒说明书步骤及方法进行。

1.3.4荧光PCR法 按照人类红细胞RHD基因分型检测试剂盒说明书步骤操作及结果分析判读。荧光PCR扩增检测条件：95℃ 2 min 30 s；94℃ 15 s、65℃(信号采集点)55 s，35个循环。

1.3.5PCR-SSP法 文献报道[3]针对中国汉族人群最常见“亚洲型”DEL血型等位基因RHD*01EL.01(即RHD*1227A基因型)引物序列，同时使用阴、阳对照进行PCR-SSP试验。PCR扩增条件：94℃预变性5 min,接着94℃30 s,62℃30 s，72℃15 s，35次，72℃5 min之后，4℃退火延伸。

1.3.6熔解曲线分析法 按照文献报道[4]对标本进行熔解曲线分析,反应程序为:95℃ 15 s;60℃ 1 min，以0.2℃/s 的升温速度升温至95℃，收集此温度范围内的荧光信号。熔解曲线分析程序结束后，自动生成1个熔解曲线。结果使用ABI 7500系统自带的溶解曲线分析程序进行分析。

1.4 统计学处理

用Excel 2017进行数据整理，应用SPSS 23.0软件进行统计学分析。不同方法检出率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。Kappa值在0.41-0.60为中度的一致性；Kappa值在0.61-0.80为高度一致性。

2 结果

2.1 4种检测方法检出率比较

见表1。

表1 4种检测方法检出率比较

组间比较，χ2值为1.275，P>0.05结果无统计学意义

2.2 4种检测方法一致性比较

见图1。

图1 4种检测方法一致性比较

3 讨论

DEL表型在20世纪80年代发现于东亚，是一种具有很微弱D抗原的血型[5]。中国人群中超过95%的DEL血型个体的分子遗传背景为RHD*01EL.01等位基因(即RHD*1227A)。以往常用传统血型血清学的吸收放散法进行检测，但是操作复杂且周期长，随着分子生物学法发展，有文献报道采用PCR-SSP法和熔解曲线分析法检测DEL血型[3-4]，新近又出现了荧光PCR法。本研究对这几种检测方法进行比较，并分析操作的影响因素。统计结果表明4种检测方法结果检出率(P>0.05)无显著性差异,传统吸收放散法检出率最高，但是经过后续分子生物学实验发现存在个别假阳性情况。与吸收放散法比较，检测结果一致性从高到低分别为荧光PCR法、熔解曲线分析法、PCR-SSP法。

经过对比我们总结如下：吸收放散法优点是试剂价格便宜，需要设备简单，适合基层单位开展，但是操作过程中要掌握好细节提高准确性，细胞要多次洗涤彻底，酸放散过程需严格把控反应时间及离心时间，注意中和显色度，避免中和时间过长，影响结果；荧光PCR法优点是特异性好，结果好判定且耗时短，但是试剂费用大，实验中需注意保证反应板及盖板膜的洁净，以免造成荧光污染；熔解曲线分析法优点是价格低，实验人员要有一定分子生物学经验，判读结果时，按照Tm值(熔解温度)区分不同等位基因。PCR-SSP法由于成本低及操作便利得到广泛应用，但是由于人员操作、试剂质量、设备状态等原因容易出现非特异性条带或扩增失败，导致假阴性或假阳性，影响结果判读。

综上所述，通过几种“亚洲型”DEL血型检测方法的比较分析，了解各自优缺点，实验室可以根据自身条件选择准确、合理的检测方案。