林可霉素发酵培养基原材料替代

丁立波

摘要：通過使用当地易得的农副产品替代摇瓶培养基中的低温黄豆饼粉，接种后培养检测发酵最终的效价，在亚麻粕、高粱蛋白粉、葵粕中优选出葵粕具有替代的可行性。结果表明在发酵生产中使用有机氮源葵粕按0.95：1比例替代配方中的低温黄豆饼粉，可提高林可霉素A效价2.2%，原材料成本每月可节约50.7万元。尤其可大幅提高最终成品质量，发酵液中降低杂质林可霉素B效价24.1%。

关键词：林可霉素、培养基、有机氮源

林可霉素为林可酰胺类抗生素，是由林可酰胺（Lincosamide，LSM）和丙基辅氨酸（Propylproline，PPL）两部分缩合后修饰而成，丙基辅氨酸是由L-酪氨酸合成而来[1]。实际生产中也需要使用大量的低温黄豆饼粉补加，来补充发酵培养过程中的有机氮源，供菌体生长及产抗利用。通过使用本地较丰富、价格低廉的高粱蛋白粉、亚麻籽粉、葵粕按照粗蛋白含量等量换算替代基础培养基中的低温黄豆饼粉从理论上是可行的。

1材料与方法

1.1菌种

林可霉素生产菌林肯链霉菌（菌LK20-14）由宁夏泰益欣生物科技有限公司菌种中心提供。

1.2培养基

斜面培养基（%， W/V）：低温黄豆饼粉0.62，淀粉2.1，KNO32，NaCl0.06，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O0.06，FeSO4 ·7H2O0.002，pH7.0～7.5;

摇瓶种子培养基（%， W/V）：低温黄豆饼粉2，淀粉2.1，葡萄糖1.1，（NH4）2 SO4 0.2，CaCO3 0.5，pH7.0;

摇瓶发酵培养基：发酵培养基（%， W/V）：低温黄豆饼粉 3.1，葡萄糖10.5，玉米浆0.32、（NH4）2SO4 0.82，NaCl 0.60，K2HPO4 0.02，NaNO3 0.82，CaCO3 0.81，pH7.0，

1.3实验方法

1）斜面培养：玻璃棒沾取菌悬液，在斜面培养基涂抹均匀，培养温度29～31℃，相对湿度16%～24%的环境下倒置，培养7～8d。

2）摇瓶种子培养：从斜面挑取单菌落接种摇瓶，培养基装量30mL/300mL三角瓶，培养温度 29～31℃，相对湿度15%～25%，摇床转速220r/min条 件下培养48～52h。

3）摇瓶发酵培养：待种子到培养周期后，将种子接入发酵摇瓶，培养基装量35mL/300mL三角瓶，培养温度29～31℃， 相对湿度15%～25%，摇床转速220r/min条件下培养 72h。

4）放大培养：150kL机械搅拌发酵罐，29.5～30.5℃、罐压0.025～0.035MPa、接种量40%培养。

2实验结果

低温黄豆饼粉替代物的优化选择

低温黄豆饼粉为有机氮源，含有丰富的粗蛋白、有机磷，本次实验选用的三种替代物料依据粗蛋白含量计算替代物使用量，其中高粱蛋白粉、葵粕（浸提）按1：1量替代，亚麻粕1.3：1替代相应比例的低温黄豆饼粉。综合发酵单位及成本，葵粕（浸提）市场供应充足、价格低廉、替代后发酵单位林可霉素A组分较好。选定葵粕（浸提）为最佳低温黄豆饼粉替代原材料。

2.2葵粕最佳替代比例确定

由粗蛋白含量确定替代比例，但某些氨基酸及维生素含量差异需要实验不同比例替代对发酵单位的影响，实验验证全部替代低温黄豆饼粉所需的葵粕量，由下图可以看出，当葵粕的替代比例为0.95：1时，发酵单位可达到最高，观察摇瓶菌丝形态及发酵液离心湿重均正常。确定最佳替代比例葵粕：低温黄豆饼粉为0.95：1。

2.3 150kL发酵罐大生产放大实验

为检验摇瓶实验结果在发酵大生产中的效果，依据摇瓶替代比例，在发酵生产中按0.95：1使用葵粕替代四级发酵罐培养基中的低温黄豆饼粉，连续进十批实验验证。

从表4可以看出，替代后的平均发酵单位A组分效价较未替代前的平均单位高2.2%，使用葵粕较低温黄豆饼粉价格成本低，月可为车间节约50.7万元。产品质量有较大提升，其中B组分效价替代后有较大幅度下降，发酵放罐B组分下降24.1%。

讨论

由表1葵粕的粗蛋白含量与低温黄豆饼粉含量相同，通过粗蛋白含量等量换算可以有效替代有机氮源，因其中氨基酸和其他物质含量的不同，对林可霉素发酵单位有不同影响，需要适当调整替代比例，最佳替代比例为0.95：1。

林可霉素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸作为甲基供体，在蛋氨酸腺苷转移酶的催化下，蛋氨酸与ATP作用，生成S腺苷蛋氨酸（SAM）。SAM中的甲基十分活泼，称活性甲基，SAM称活性蛋氨酸。SAM在甲基转移酶的催化下，可将甲基转移给另一物质，使甲基化[3][4]。葵粕蛋氨酸及胆碱含量相对低温黄豆饼粉较高，为林可霉素A生物合成中三个甲基化步骤提供了较多的甲基供体。本次使用葵粕替代即降低了发酵罐培养基的物料成本，又降低了杂质组分林可霉素B的含量。

参考文献

[1]刘瑞华.林可霉素生物合成的研究进展[J].微生物学通报，2018，45（05）：1138-1145.

[2]中国饲料数据库.FeedStuff（2017）常规饲料成分[EB/OL].http：//www.chinafeeddata.org.cn/picture/pdf/CFICout2017_1.pdf.

[3]Ushimaru R， Lin CI， Sasaki E， et al. Characterization of enzymes catalyzing transformations of cysteine S-conjugated intermediates in the lincosamidebiosynthetic pathway[J]. ChemBioChem， 2016， 17（17）： 1606-1611.

[4] Hou BB， Lin YW， Wu HZ， et al. The novel transcriptional regulator lmbU promotes lincomycin biosynthesis through regulating expression of its target genes in Streptomyces lincolnensis[J]. Journal of Bacteriology， 2018， 200（2）： e00447-17.