Ambra1介导自噬对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

王连涛，甘云辉，李应军，温华生

（深圳市中西医结合医院胃肠外科，广东深圳 518104）

肝癌是临床常见的恶性肿瘤[1]。研究表明，自噬参与多种肿瘤的发生及发展，如结直肠癌、舌癌、宫颈癌。自噬是细胞中一个极其精细的过程，由自噬相关基因ATG（autophagy-related genes）调控，目前已有超过34个自噬相关基因从酵母中分离出来[2]。Ambra1可以调节自噬过程的发生和发展，其可促进或抑制肿瘤的发生发展[3]。Ambra1具有促肿瘤作用，其介导的自噬可保护肿瘤细胞；同时Ambra1还可能通过调节其他信号通路发挥抗肿瘤作用。目前该因子在肝癌方面的研究报道很少。本研究通过选取肝癌细胞HepG2做为本研究细胞系并构建shRNA慢病毒，从而探究Ambra1介导自噬对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 重组慢病毒载体的构建 Bam HI和Eco RI双酶切目的基因分别回收shAmbra1组和shAmbra1+3-MA基因片段，再分别克隆于经Bam HI和Eco RI双酶切的慢病毒p PLK/GFP/+Puro载体。

1.2 细胞分组与处理 shNon组：细胞分别以相应慢病毒载体感染shAmbra1组和shAmbra1+3-MA基因片段后，在无氨基酸无血清的EBSS培养液中培养8~12 h；shAmbra1组：细胞分别以相应慢病毒载体感染sh Ambra1+3-MA基因片段后，在无氨基酸无血清的EBSS培养液中培养8~12 h；sh Ambra1+3-MA组：细胞在用无氨基酸无血清的EBSS培养液培养前1 h加入3-MA（10 mmol/L），于倒置显微镜下观察细胞形态的改变。

1.3 观察指标

1.3.1 细胞自噬的检测 通过Western blotting法检测细胞自噬蛋白，包括微管相关蛋白1轻链3-I（LC3-I）、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、酵母ATG6同源物（Beclin-1）和自噬相关基因5（ATG5）表达。

1.3.2 MTS法 检 测 细 胞 增 殖 能 力 shNon组、sh Ambra1组 和shAmbra1+3-MA组 细 胞 感 染72 h后，在无氨基酸无血清的EBSS培养液中培养8~12 h，分别用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液。连续观察5 d，计算细胞增殖率。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 shNon组、sh Ambra1组和shAmbra1+3-MA组细胞感染72 h后，在EBSS培养液中培养12 h，采用AnnexinV/FITC检测试剂盒检测细胞凋亡水平。

1.4 统计学方法 本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件进行处理；计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析、重复测量的方差分析以及析因设计方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别细胞自噬相关蛋白表达 shNon组细 胞 自 噬 相 关 蛋 白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5表达高于shAmbra1组和shAmbra1+3-MA组，而shAmbra1组细胞自噬相关蛋白表达高于shAmbra1+3-MA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同组别细胞自噬相关蛋白表达

2.2 不同组别细胞增殖能力 随着培养时间延长，3组细胞的增殖能力降低，且shNon组细胞增殖能力高于shAmbra1组 和shAmbra1+3-MA组，而shAmbra1组细胞增殖能力高于shAmbra1+3-MA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同组别细胞增殖能力

2.3 不同组别细胞凋亡能力 随着培养时间延长，3组细胞的凋亡能力均增大，且shNon组凋亡率小于shAmbra1组 和shAmbra1+3-MA组，而shAmbra1组细凋亡率小于shAmbra1+3-MA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同组别细胞凋亡能力

3 讨论

近年来，有研究学者对酵母和哺乳动物细胞中参与自噬调控的一系列基因进行了研究，结果发现，在肝癌细胞中Ambra1能够促进自噬过程的发生发展，同时还可以抑制肿瘤细胞凋亡的发生[5]。本研究表明，细胞凋亡能力变化趋势则与增殖能力变化趋势相反。

自噬是细胞处于生长环境恶劣或者缺乏营养时采取的一种自我保护方式，此时细胞主要是通过分解自己内部的营养成分并反复循环再利用来维持生存。自噬过程的发生主要针对的是细胞内底物，包括细胞器以及一些性质特殊的蛋白复合物，最终被溶酶体降解，发生再循环。近年来，研究学者对酵母和哺乳动物细胞中参与自噬调控的一系列基因进行了研究，结果发现[5]，在肝癌细胞中Ambra1能够促进自噬过程的发生发展，同时还可以抑制肿瘤细胞凋亡的发生。

肝癌细胞HepG2在凋亡诱导剂的刺激下表现出了Ambra1的降解，这种Ambra1的降解效应表明Ambra1在肝癌细胞中可能发挥着抑制凋亡的作用。并且，LC3-I、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5的激活与细胞凋亡存在密切的相关性，表明Ambra1降解的原因可能与微管相关蛋白或自噬相关蛋白有关，并且通过本次研究也进一步确认了Ambra1介导自噬对肝癌细胞增殖和凋亡的影响与上述蛋白的共同作用有关。笔者分析认为Ambra1作为肿瘤抑制因子参与了肿瘤的发生和发展[6]。Ambra1可能通过调控上皮间质转化（EMT）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[7-9]。目前对于Ambra1抑制肿瘤的机制，认为Ambra1联合自噬适配体LC3对是否有E3连接酶PARKIN的线粒体清除都非常重要，即Ambra1可以通过介导线粒体自噬抑制肿瘤[10-12]。

综上所述，在肝癌细胞HepG2中，肿瘤细胞通过自噬抵抗外部环境给予的压力，Ambra1在正性调控自噬的同时负性调控凋亡。因此，Ambra1在肝癌中调节细胞增殖和凋亡的机制可能会为肝癌的进一步治疗提供相应的理论基础和研究策略。